Isolamento e caracterização do gene CaLTP em Coffea spp

Abstract

As proteínas de transferência de lipídeos não-específicas (nsLTPs) são proteínas básicas caracterizadas por resíduos de cisteínas conservados, baixa massa molecular e alto conteúdo de α-hélices. Tais proteínas foram originalmente definidas pela capacidade de transferir fosfolipídeos in vitro. As nsLTPs estão envolvidas nos mecanismos de proteção das plantas contra estresses bióticos causados por fungos, vírus e bactérias. Evidências evolutivas sugerem que essas proteínas surgiram muito cedo durante a evolução das plantas terrestres. Uma família multigênica confere a expressão dos genes nsLTPs, o que pode explicar o padrão de expressão diferencial de acordo com o tecido, estádio de desenvolvimento e condições fisiológicas. Esses genes são responsivos a estresses abióticos tais como déficit hídrico, baixas temperaturas, salinidade e exposições a metais pesados. Considerando a importância das nsLTPs no metabolismo das plantas, o presente estudo objetiva: (i) identificar os diferentes genes nsLTPs homoeólogos de café que correspondem aos subgenomas ancestrais de Coffea arabica (Ca): Coffea canephora (Cc) e Coffea eugenioides (Ce); (ii) avaliar a expressão desses alelos durante o desenvolvimento do fruto (iii) estudar os efeitos da seca na expressão das nsLTPs em C. arabica; (iv) clonar o promotor de um dos genes codificando nsLTP de C. arabica e testar sua regulação em plantas de tabaco transgênicas. Northern eletrônico foi realizado com os dados do Projeto Genoma EST Brasileiro e identificou-se o gene CaLTP (Coffea arabica Lipid Transfer Protein) altamente expresso em frutos de café. Os resultados dessa análise in silico foram confirmados por ensaios de RT-qPCR e de Northern blot, os quais destacaram a expressão preferencial deste gene em endosperma nos frutos de C. arabica aos 90 e 120 dias após a floração (DAF). A região promotora do gene CaLTP3 (1,2 kb) foi isolada. Deleções 5’ nessa sequência foram feitas para testar a capacidade de controlar a expressão do gene repórter uidA em plantas transgênicas de Nicotiana tabacum. Os ensaios histoquímicos da atividade GUS mostram que os fragmentos de 1,2 kb, 1,0 kb e 0,8 kb direcionaram a expressão de uidA para todos os órgãos testados da planta. Esses fragmentos promovem expressão baixa ou nula em raízes. O fragmento de 0,4 kb direcionou a expressão do gene uidA somente em sementes. As expressões dos homoeólogos CaLTP dos subgenomas de Cc e Ce de Ca foram identificadas usando combinações específicas de iniciadores. Os cDNAs e os genes codificando a proteína nsLTP, do tipo 2, foram clonados e sequênciados permitindo a identificação das formas ortólogas e homeólogas da CaLTP (CaLTP1a, CaLTP1b, CaLTP2, CaLTP3a, CaLTP3b e CcLTP3).

The non-specific lipid transfer proteins (nsLTPs) are basic proteins characterized by conserved cysteine residues, low molecular mass and high content of α-helices that were originally defined according to their ability to transfer phospholipids in vitro. Several studies indicate that nsLTPs are involved in protection mechanisms of plants against biotic stresses caused by fungi, virus and bacteria. The lipid transfer proteins are widely distributed in plant kingdom and evolutionary evidences suggest that nsLTP proteins emerged very early during land plant evolution, which may explain the large diversity of their corresponding genes. The differential expression patterns according to tissue, developmental stage and physiological condition are conferred by nsLTP- multigene family. These genes are also responsive to abiotic stresses such as drought, low temperature, salt treatment and heavy metals exposure. Considering the importance of nsLTPs in plant metabolism, the present study aims to (i) identify the different coffee nsLTPs gene homeologs corresponding to Coffea arabica (Ca) ancestor subgenomes: Coffea canephora (Cc) and Coffea eugenioides (Ce); (ii) evaluate the expression of these alleles during bean development; (iii) study the effects of drought on nsLTP expression in C. arabica and (iv) clone the promoter of one of genes enconding C. arabica nsLTP and to evaluate its function in transgenic tobacco plants. Electronic Northern were performed using electronic data from the Brazilian Genome Project EST and identified the CaLTP (Coffea arabica Lipid Transfer Protein) gene as highly expressed in coffee fruits. Results of these in silico analyses were validated by RT-qPCR and Northern blot assays which highlighted the preferential expression in C. arabica fruit endosperm at 90 and 120 days after flowering (DAF). The corresponding CaLTP3 gene promoter region (1,2 kb) was also isolated. 5’ end deletions of this sequence were carried out to evaluate their ability to control the expression of the uidA reporter gene in transgenic Nicotiana tabacum plants. The GUS histochemical assay showed that 1,2 kb, 1,0 kb and 0,8 kb fragments direct the uidA expression to all tested plant organs. Those three fragments (1,2 kb, 1,0 kb and 0,8 kb) promote low or null expression in roots. On the other hand, the 0,4 kb fragment led to the expression of the uidA gene only in seeds. The expression of CaLTP-specific homeologus from Cc and Ce subgenomes of Ca was also identified using several specific primers combination. The cDNAs and genes encoding the nsLTP type 2 protein were cloned and sequenced that allowed the identification of CaLTP homeologous and orthologous sequences (CaLTP1a, CaLTP1b, CaLTP2, CaLTP3a, CaLTP3b e CcLTP3).