Análise funcional da região promotora de haplótipos do gene CcDREB1D de Coffea canephora via transformação genética de Nicotiana tacabum cv. SRI

Abstract

Estudos recentes resultaram na identificação de vários genes candidatos para tolerância à seca que apresentaram expressão diferencial contrastante entre genótipos. Dentre esses, encontram-se genes integrantes da via de resposta ao estresse hídrico, tais como os fatores de transcrição DREB. Resultados da expressão do gene CcDREB1D nas folhas dos clones 14 (tolerante) e 22 (sensível) de Coffea canephora Conilon mostraram uma maior expressão desse gene em condição de défice hídrico no clone 14 comparado ao clone 22. Após sequenciamento, polimorfismos na região promotora do gene CcDREB1D, que podem indicar a participação de três haplótipos (15, 16 e 17) no controle genético da tolerância à seca, foram identificados nos clones 14 e 22. Visando estudar a participação dos polimorfismos na resposta à seca, várias construções gênicas, com diferentes fragmentos da região promotora do gene CcDREB1D, foram arquitetadas no vetor binário pBI101 e testadas via transformação genética de Nicotiana tabacum cv. SRI, a fim de avaliar a capacidade dos fragmentos de controlarem a expressão do gene repórter β-glucuronidase (uidA). Testes histoquímicos indicaram uma forte atividade GUS (forte coloração) correspondente ao controle positivo (pBI121) enquanto que nenhuma atividade GUS foi detectada para o controle negativo (pBI101). Tanto nas folhas, como nas raízes, uma expressão basal do gene uidA foi verificada nas plantas T0 sem estresse, sobretudo para as construções contendo as versões mais longas (D) do pDREB1D. Para verificar se a região promotora dos haplótipos do gene CcDREB1D responderiam aos estresses abióticos, as plantas transformadas de tabaco foram submetidas a ensaios de desidratação e de temperatura elevada e a expressão do gene repórter uidA foi analisada por testes histoquímicos GUS e PCR quantitativa em tempo real (qPCR). Experimentos de qPCR confirmaram uma leve indução do gene uidA nas folhas das plantas T0 transformadas com pD22-hp17D. No entanto, os níveis de expressão deste gene foram muito inferiores aos das plantas transformadas com o controle positivo (pBI121). Nenhuma indução do gene repórter foi observada nas plantas transformadas com as diferentes construções contendo os outros haplótipos (15 e 16) do promotor CcDREB1D. Contudo, esses resultados mostraram que (1) os promotores pDREB1D de C. canephora são fracos em tabaco, (2) o promotor do haplótipo 17 oriundo do clone 22 de C. canephora é induzido com estresses abióticos nas folhas de tabaco, mostrando que os mecanismos moleculares implicados na regulação da expressão gênica em resposta à seca são (pelo menos parcialmente) conservados entre cafeeiro e tabaco, e que (3) o funcionamento dos promotores pDREB1D dos clones 14 e 22 de cafeeiro é diferencial em tabaco, sugerindo que os polimorfismos identificados nesses promotores participam da regulação destas sequências.

Recent studies resulted in the identification of many candidate genes for drought tolerance presenting contrasted differential expression profiles between genotypes. Among those are found the genes involved in the water stress response pathway, such as the DREB transcription factors. Results of CcDREB1D gene expression in the leaves of clones 14 (tolerant) and 22 (sensitive) of Coffea canephora Conilon, showed higher expression for clone 14 than clone 22 under water stress conditions. After sequencing, the polymorphisms identified in the promoter region of CcDREB1D gene in clones 14 and 22, may indicate the participation of three haplotypes (15, 16 and 17) in the genetic control for drought tolerance. With the aim of studying the participation of these polymorphisms in the response to drought, several genetic constructions of the CcDREB1D promoter regions were made in the pBI101 binary vector and tested via genetic transformation of Nicotiana tabacum cv. SRI, in order to evaluate the capacity of such fragments in controlling the expression of the β-glucoronidase (uidA) reporter gene. Histochemical tests indicated a strong GUS activity (high coloration) for the positive control (pBI121) while no GUS activity was detected for the negative control (pBI101). In both leaves and roots, a basal expression of uidA gene was observed for the T0 plants without drought stress, especially for the constructions containing the longest versions (D) of the pDREB1D. To verify if the promoters of the CcDREB1D gene haplotypes would respond to abiotic stresses, transformed tobacco plants were submitted to dehydration and elevated temperature assays, and subsequently analyzed for the expression of the uidA reporter gene by GUS histochemical tests and real time quantitative PCR (qPCR). A slight induction of the uidA gene in the leaves of transformed T0 plants was confirmed with pD22- hp17D in qPCR experiments. However, the expression levels of this gene were highly inferior to those of the plants transformed with the positive control (pBI121). No induction of the reporter gene was observed in plants transformed with the different constructions containing the other haplotypes (15 and 16) of the CcDREB1D promoter. Altogether, these results showed that: (1) the pDREB1D promoters of C. canephora are weak in tobacco; (2) the promoter for haplotype 17, derived from C. canephora clone 22, is induced with abiotic stresses in the tobacco leaves, demonstrating that the molecular mechanisms implicated in the regulation of the gene expression in response to drought are (at least partially) conserved between coffee and tobacco plants; and (3) that the functioning of the pDREB1D promoters of coffee clones 14 and 22 is different in tobacco, suggesting that the polymorphisms identified in these promoters participate in the regulation of these sequences