Identificação e caracterização de genes que codificam proteínas secretadas por Hemileia vastatrix na interação com o cafeeiro

Abstract

A ferrugem causada pelo fungo biotrófico Hemileia vastatrix é a doença mais importante do cafeeiro, pois atinge, com gravidade, grandes áreas de lavouras, onde causa prejuízos na produtividade e seu controle aumenta os custos de produção. O presente trabalho teve por objetivo identificar genes de H. vastatrix que codificam proteínas secretadas que possam funcionar como efetores necessários para o estabelecimento da interação biotrófica e, ou, como desencadeadores de respostas de resistência, por meio da análise de um banco constituídos por 9828 etiquetas de sequências expressas (ESTs) em uma interação suscetível. Essas ESTs foram geradas pelo sequenciamento da extremidade 5 ́de clones de cDNA de uma biblioteca construída a partir de mRNA isolado de folhas de cafeeiro coletadas 12 dias após a inoculação com o isolado monopustular HV-01. Foram obtidos 1004 contíguos e 3301 singletos após o alinhamento das sequências pelo programa CAP3. A partir de 890 transcritos únicos que codificam proteínas sem similaridade a sequências do banco não redundante do GenBank/NCBI e que não possuíam identidade a sequências de Coffea spp. também depositadas nesse banco de dados, foram obtidas 46 ORFs que codificam peptídeos com mais de 60 aminoácidos e predição positiva em cinco ou mais parâmetros do algoritmo de predição de sequências sinal de exportação SignalP. Foram selecionados cinco genes que tiveram a região da ORF amplificada do genoma de H. vastatrix, gerando fragmentos iguais ou maiores aos amplificados a partir do cDNA. Esses genes, exclusivos de H. vastatrix, não mostraram identidade com sequências únicas derivadas de esporos germinados desse patógeno, demonstrando que a sua expressão ocorre no interior do tecido infectado. A secreção das proteínas codificadas por quatro genes foi confirmada em levedura. Estudos funcionais deverão ser realizados para comprovar a atividade efetora dos genes caracterizados, assim como dos demais genes identificados nesse estudo, cuja origem fúngica e secreção das proteínas preditas em levedura seja demonstrada.

The coffee leaf rust caused by the biotrophic fungus Hemileia vastatrix, it is the most important fungal disease of coffee, causing productivity losses and its control increases the costs of coffee production. This study aimed to identify genes of H. vastatrix that encode secreted proteins that may function as effectors needed for the establishment of the biotrophic interaction and / or as triggers of resistance responses, by analyzing a database consisting of 9828 expressed sequence tags (ESTs) from an susceptible interaction. These ESTs were generated by sequencing the 5' end of cDNA clones from a library constructed from mRNA isolated from coffee leaves collected 12 days after inoculation with single pustule isolation HV-01. It was obtained 1004 contigs and 3301 singlets after clustering the sequences using the CAP3 program. From 890 unique transcripts that encode proteins without similarity to sequences of non-redundant database of GenBank / NCBI, which had no identity to sequences of Coffea spp., also deposited in this database, were identified 46 ORFs that encode peptides over 60 amino acids with positive prediction from five or more parameters of algorithms used to predict secretion signal sequences. We selected five genes which were amplified from the H. vastatrix genome, generating fragments equal or higher than those amplified from cDNAs. These genes, unique to H. vastatrix showed no identity with cDNA sequences derived from germination spores, demonstrating that their expression may occur within the infected tissue. The secretion of proteins encoded by four genes was demonstrated using the Yeast Secretion System. Functional studies should be conducted to confirm the effector activity of the genes characterized, as well as from other genes identified in this study, whose origin and secretion of fungal the predicted proteins in yeast has been demonstrated.