Teses e Dissertações
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Item Marcadores microssatélites para Coffea arabica L.(Universidade Federal de Viçosa, 2008-07-21) Missio, Robson Fernando; Sakiyama, Ney Sussumu; Caixeta, Eveline Teixeira; Zambolim, Eunize Maciel; Dias, Luiz Antônio dos SantosOs marcadores microssatélites (SSR) são desejáveis para estudos genéticos e seleção assistida por marcadores. A limitada disponibilidade destes marcadores para Coffea arabica, uma das principais culturas em importância sócio-econômica do mundo, justifica novos esforços para o desenvolvimento de marcadores SSR. Portanto, o objetivo deste trabalho foi desenvolver, caracterizar e avaliar a utilização de marcadores SSR para estudos da diversidade genética em Coffea. Duas bibliotecas genômicas enriquecidas para as sequências repetidas (GT) 15 e (AGG) 10 foram construídas, utilizando-se o DNA genômico do genótipo Bourbon Amarelo UFV 570. Um total de 756 clones positivos, com seqüências de boa qualidade, foi utilizado para a localização de 287 SSR e o desenho de 96 pares de primers SSR. Aproximadamente 15% dos clones foram redundantes. As repetições de dinucletídeos foram mais freqüentes que os tri- e tetranucleotídeos, sendo as classes AG (32,8%), AC (12,9%), AAG (9,8%) e AGG (5,6%) as mais abundantes na porção analisada do genoma de C. arabica. Em média, foi encontrado um SSR a cada 1,45kb. Do total de 96 primers SSR desenhados e sintetizados, 90 (94%) foram validados como marcadores SSR úteis para estudos genéticos em C. arabica, sendo 21 (23%) polimórficos entre os cafeeiros Híbrido de Timor UFV 445-46 e Catuaí UFV 2143-235. Trinta e três primers SSR foram analisados em 24 acessos de Coffea importantes para o programa de melhoramento da UFV/EPAMIG. O número médio de alelos por primer foi de 5,1 e os valores médios de PIC foram de 0,56 para C. canephora e de 0,22 para C. arabica, variarando de 0,08 a 0,79 entre todos os acessos avaliados. Neste trabalho, também, foi comparada a eficiência de 18 marcadores SSR genômicos e 17 EST-SSR para o estudo da diversidade genética em Coffea. O número médio de alelos/primer foi de 5,1 e 5,3 para os marcadores EST-SSR e SSR genômico, respectivamente. Os marcadores SSR genômicos apresentaram maior número de alelos exclusivos e foram mais polimórficos dentro e entre os grupos genéticos, quando comparado com os EST-SSR. Os SSR genômicos apresentaram também maiores coeficientes de dissimilaridade genética e maior número de alelos discriminantes e foram eficientes em distinguir todos os acessos estudados. Os resultados demonstraram o potencial dos marcadores SSR genômicos na detecção do nível de polimorfismo, dos alelos exclusivos e da dissimilaridade genética, viitornando-os úteis para estudos de diversidade genética em Coffea, principalmente em C. arabica que apresenta pequena variabilidade genética. Este trabalho aumentou o número de marcadores SSR disponíveis para estudos genéticos em C. arabica e espécies relacionadas do gênero Coffea importantes para o melhoramento genético.Item Caracterização de seqüências expressas do genoma café potencialmente relacionadas com a resistência a doenças(Universidade Federal de Viçosa, 2007-07-16) Alvarenga, Samuel Mazzinghy; Sakiyama, Ney SussumuSeqüências potencialmente envolvidas na resistência do cafeeiro a doenças foram identificadas, por meio de análise in silico, a partir das informações geradas pelo Projeto Brasileiro do Genoma Café (PBGC). Para isso foram usadas três estratégias. Inicialmente, palavras-chave correspondentes a termos relacionados aos mecanismos de resistência de plantas a patógenos foram identificadas na literatura e utilizadas como “iscas” para a mineração dos dados. Com o auxílio de ferramentas disponíveis na plataforma de bioinformática do PBGC, foram identificadas ESTs (Expressed Sequence Tags) relacionadas a cada uma destas palavras. Outra estratégia utilizada foi a busca por similaridades entre algumas seqüências públicas envolvidas com a resistência do cafeeiro a doenças com as seqüências do PBGC, por meio do programa BLAST. Utilizou-se, também, o Electronic Northern, uma ferramenta desenvolvida pelo Laboratório de Genômica e Expressão (LGE). A mineração, usando as três estratégias, identificou 14.060 seqüências do PBGC. Essas seqüências apresentaram similaridade com proteínas conhecidamente relacionadas com o processo de defesa da planta contra doenças como, por exemplo, quitinase, proteína quinase, citocromo P450, proteína de resistência a doenças, proteína relacionada com patogênese, proteínas com domínio LRR e NBS, proteínas induzidas por hipersensibilidade, entre outras. Os processos biológicos com os quais essas seqüências estão envolvidas incluíram metabolismo, transporte, regulação da transcrição, enovelamento de proteínas, biossíntese entre outros. A análise global baseada em ontologia de função molecular das seqüências obtidas mostrou que os genes estão envolvidos com metabolismo, resposta a estímulos externos, diferenciação celular, ligação a ácidos nucléicos, ligação a nucleotídeos, resposta de defesa, apoptose entre outras. Visando verificar o envolvimento destas seqüências com a resistência do cafeeiro à ferrugem foram desenhados 40 primers para amplificar algumas das seqüências mineradas. Os primers foram desenhados com o programa computacional Primer3 e a estabilidade desses foi verificada por meio do programa PrimerSelect. Diferentes concentrações dos componentes da reação de PCR foram analisadas. Utilizando as condições de reação e amplificação otimizadas, os 40 primers foram testados em 12 genótipos resistentes e 12 susceptíveis a Hemileia vastatrix, fungo causador da ferrugem. Vinte e nove destes 40 primers resultaram em bandas únicas e bem definidas, sendo um polimórfico. Este trabalho permitiu obter, até o momento, um marcador molecular polimórfico entre os indivíduos resistentes e susceptíveis. Esse marcador, denominado CARF 005, amplifica uma região do DNA que corresponde a uma ORF parcial de Coffea arabica que codifica uma proteína de resistência a doenças.