Teses e Dissertações
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Item Marcadores microssatélites para Coffea arabica L.(Universidade Federal de Viçosa, 2008-07-21) Missio, Robson Fernando; Sakiyama, Ney Sussumu; Caixeta, Eveline Teixeira; Zambolim, Eunize Maciel; Dias, Luiz Antônio dos SantosOs marcadores microssatélites (SSR) são desejáveis para estudos genéticos e seleção assistida por marcadores. A limitada disponibilidade destes marcadores para Coffea arabica, uma das principais culturas em importância sócio-econômica do mundo, justifica novos esforços para o desenvolvimento de marcadores SSR. Portanto, o objetivo deste trabalho foi desenvolver, caracterizar e avaliar a utilização de marcadores SSR para estudos da diversidade genética em Coffea. Duas bibliotecas genômicas enriquecidas para as sequências repetidas (GT) 15 e (AGG) 10 foram construídas, utilizando-se o DNA genômico do genótipo Bourbon Amarelo UFV 570. Um total de 756 clones positivos, com seqüências de boa qualidade, foi utilizado para a localização de 287 SSR e o desenho de 96 pares de primers SSR. Aproximadamente 15% dos clones foram redundantes. As repetições de dinucletídeos foram mais freqüentes que os tri- e tetranucleotídeos, sendo as classes AG (32,8%), AC (12,9%), AAG (9,8%) e AGG (5,6%) as mais abundantes na porção analisada do genoma de C. arabica. Em média, foi encontrado um SSR a cada 1,45kb. Do total de 96 primers SSR desenhados e sintetizados, 90 (94%) foram validados como marcadores SSR úteis para estudos genéticos em C. arabica, sendo 21 (23%) polimórficos entre os cafeeiros Híbrido de Timor UFV 445-46 e Catuaí UFV 2143-235. Trinta e três primers SSR foram analisados em 24 acessos de Coffea importantes para o programa de melhoramento da UFV/EPAMIG. O número médio de alelos por primer foi de 5,1 e os valores médios de PIC foram de 0,56 para C. canephora e de 0,22 para C. arabica, variarando de 0,08 a 0,79 entre todos os acessos avaliados. Neste trabalho, também, foi comparada a eficiência de 18 marcadores SSR genômicos e 17 EST-SSR para o estudo da diversidade genética em Coffea. O número médio de alelos/primer foi de 5,1 e 5,3 para os marcadores EST-SSR e SSR genômico, respectivamente. Os marcadores SSR genômicos apresentaram maior número de alelos exclusivos e foram mais polimórficos dentro e entre os grupos genéticos, quando comparado com os EST-SSR. Os SSR genômicos apresentaram também maiores coeficientes de dissimilaridade genética e maior número de alelos discriminantes e foram eficientes em distinguir todos os acessos estudados. Os resultados demonstraram o potencial dos marcadores SSR genômicos na detecção do nível de polimorfismo, dos alelos exclusivos e da dissimilaridade genética, viitornando-os úteis para estudos de diversidade genética em Coffea, principalmente em C. arabica que apresenta pequena variabilidade genética. Este trabalho aumentou o número de marcadores SSR disponíveis para estudos genéticos em C. arabica e espécies relacionadas do gênero Coffea importantes para o melhoramento genético.Item Clonagem e caracterização de um novo gene putativo de resistência do cafeeiro a Hemileia vastatrix e aplicação na seleção assistida(Universidade Federal de Viçosa, 2019-03-11) Almeida, Dênia Pires de; Caixeta, Eveline Teixeira; Zambolim, LaércioA ferrugem do cafeeiro, causada pelo fungo Hemileia vastatrix, é uma das doenças mais preocupantes para a cafeicultura mundial. A alta variabilidade genética desse fungo e, consequentemente, o surgimento de novas raças do patógeno, tem resultado na suplantação da resistência de cultivares lançadas pelos programas de melhoramento genético. Para desenvolver cultivares com resistência durável, é essencial o entendimento dos genes de resistência envolvidos e seus mecanismos moleculares de atuação na resistência. Dessa forma, nesse estudo, foi realizada a clonagem e caracterização molecular de um novo gene (Receptor Like Kinase) presente no Híbrido de Timor (HdT) CIFC 832/2, uma das principais fontes de resistência dos programas de melhoramento. A clonagem foi realizada a partir de screening de uma biblioteca de clones BAC (Bacterial Artificial Chromosomes), usando um gene que foi selecionado de biblioteca subtrativa entre interação compatível e incompatível de Cafeeiro-H. vastatrix. A sequência da BAC selecionada foi analisada, sendo identificado dois genes putativo para resistência do cafeeiro. Por meio de RT-qPCR, um dos genes, denominado de HdT_LRR_RLK2 (Leucine-rich repeat rececptor like kinase), apresentou pico de expressão apenas na interação incompatível, sendo esse considerado um novo gene putativo de resistência do cafeeiro a H. vastatrix. A partir desse gene caracterizado, foi desenvolvido um marcador molecular funcional, o qual foi analisado e validado em um conjunto de clones de cafeeiros diferenciadores de raças de H. vastatrix e, então, usados na seleção assistida (SAM). Na SAM, cafeeiros em diferentes gerações de melhoramento foram analisados com o marcador funcional desenvolvido, além de outros marcadores previamente obtidos e associados a diferentes genes de resistência a H. vastatrix. Foi utilizado marcadores SCAR, CAPS e SSR flanqueando dois locos (genes maiores) de resistência a raças I, II e patótipo 001 de H. vastatrix, previamente localizados em mapa genético, além de marcador funcional originado de outro gene clonado (CC-NBS-LRR) alocado em outra região do mapa genético. Nesse trabalho, também foram usados os marcadores CBD-Sat207 e CBD-Sat235 associados ao gene Ck1 de resistência a Coffee Berry Disease (CBD). Essa doença se encontra presente somente no continente africano, no entanto, o uso dos marcadores permite realizar melhoramento preventivo para essa importante doença. Nas gerações F 2 , F 3 e Retrocruzamento Suscetível (RCS 2 ) (Híbrido de Timor UFV 443-03 x Catuaí Amarelo IAC 64), as plantas foram genotipadas e fenotipadas com a raça II de H. vastatrix, para validação dos marcadores. As populações F 3:4 e RCS 3 foram genotipados com os marcadores validados. Foram identificados na F 3:4 cafeeiros com o genótipo AABBCCDDEe e no RCS 3 , genótipo AaBbCcD_E_, sendo que o loco A, B, C e D correspondem aos quatro locos de resistência a H. vastatrix e E ao loco de resistência a CBD. A SAM permitu a identificação e obtenção de piramidação de múltiplos genes de resistência a ferrugem e a CBD. Os genótipos identificados serão usados para avanço de geração e plantados para os testes de campo. O uso das estratégias de SAM e piramidação de genes têm potencial de obtenção de resistência duradoura à doenças, além de reduzir tempo, espaço e custo dos testes de campo, por permitirem o descarte de plantas contendo os alelos recessivos nos diferentes locos.Item Diversidade genética, ganhos com seleção e seleção genômica ampla na espécie Coffea canephora(Universidade Federal de Viçosa, 2017-07-31) Alkimim, Emilly Ruas; Caixeta, Eveline Teixeira; Silva, Felipe Lopes da; Resende, Marcos Deon Vilela deA presença de variabilidade genética associada a estratégias mais eficientes de seleção são imprescindíveis para se obter sucesso nos programas de melhoramento. Nesse sentido, o uso de marcadores moleculares em estudos de diversidade, bem como a seleção baseada em dados fenotípicos por meio do uso de procedimentos genético-estatísticos mais refinados têm se mostrado ferramentas úteis nos programas de melhoramento. Além disso, com o avanço das plataformas de NGS (Next Generation Sequencing), um novo método de seleção, que visa utilizar dados fenótipos e moleculares, denominado Seleção Genômica Ampla foi proposto. O objetivo do trabalho foi identificar marcadores SNP (Single Nucleotide Polymorphism) e validá-los em estudos de diversidade genética; estimar os parâmetros genéticos e os ganhos com a seleção utilizando a metodologia de modelos mistos (REML/BLUP); aplicar o princípio da GWS (Genome Wide Selection) e avaliar sua eficiência em população de C. canephora. A população em estudo, inicialmente, foi composta por 72 genótipos nos quais os marcadores SNP foram identificados e validados. A seleção fenotípica, por meio do procedimento REML/BLUP, foi realizada em 192 genótipos de cafeeiros. Por fim, a população avaliada por meio da GWS foi composta por 165 genótipos. Utilizando a plataforma de sequenciamento da empresa RAPiD Genomics foram identificados 117.450 SNP em 72 indivíduos de C. canephora. Após análises de qualidade, 33.485 SNP foram selecionados e validados em análises de diversidade e estrutura genética de populações. Os marcadores foram eficientes na avaliação da diversidade e estrutura genética de C. canephora e com base em nessas análises foi possível selecionar possíveis cruzamentos promissores dentro e entre os grupos varietais e Híbridos geneticamente mais distantes. Com base nas análises utilizando o método REML/BLUP foi possível selecionar genótipos Conilon e Robusta promissores por serem geneticamente divergentes pela análise de agrupamento e por proporcionarem ganhos elevados com a seleção. Estes podem ser intercruzados para obter cultivares dentro de cada grupo varietal e/ou como genitores em cruzamentos interpopulacionais. Além disso, foi possível selecionar famílias híbridas que se destacaram nas análises. Estas podem ser testadas em diferentes regiões e as promissoras utilizadas como variedade propagada por semente. As famílias híbridas selecionadas podem também ser intercruzadas (cruzamento intrapopulacional) para avanço da seleção recorrente. Por fim, a GWS mostrou-se ferramenta útil para o melhoramento de C. canephora, por predizer com alta acurácia os valores genéticos genômicos dos indivíduos e possibilitar a redução no tempo necessário para completar o ciclo de seleção, proporcionando ganhos significativos em eficiência seletiva por unidade de tempo.Item Estudo de associação genômica ampla (GWAS) em Coffea arabica(Universidade Federal de Viçosa, 2019-08-09) Silva, Ruane Alice da; Caixeta, Eveline Teixeira; Sousa, Tiago Vieira; Nascimento, MoysésEstudos de associação genômica ampla (GWAS) têm sido utilizados mundialmente para várias espécies de importância econômica. A metodologia possibilita inferir sobre as relações entre variações genéticas e características fenotípicas, em nível populacional, detectando efeitos significativos por meio de testes de hipóteses. O GWAS demonstra grande relevância nos programas de melhoramento, sobretudo de espécies perenes, tendo como principal objetivo identificar regiões cromossômicas e genes candidatos para o controle genético de determinada característica. No entanto, em Coffea arabica, espécie de maior importância econômica do gênero Coffea, existem poucos estudos publicados utilizando essa metodologia. Assim, objetivou-se a identificação de regiões cromossômicas que apresentam associações significativas entre marcadores e características fenotípicas de importância para a espécie C. arabica, por meio de GWAS e selecionar SNP associados para serem utilizados em seleções assistidas por marcadores moleculares. A população de trabalho foi composta por 195 indivíduos de C. arabica, pertencentes à 13 famílias em gerações F 2 , retrocruzamentos suscetíveis e retrocruzamentos resistentes à ferrugem do cafeeiro. As plantas foram fenotipadas para 18 características agronômicas durante três anos consecutivos (2014, 2015 e 2016) e genotipadas por 21.211 marcadores moleculares SNP distribuídos em todo o genoma. O GWAS possibilitou a identificação de 110 SNP com associações significativas (p<0,05) para as características: altura de plantas (AP), comprimento de ramos plagiotrópicos (CRP), número de nós vegetativos (NNV), diâmetro da copa (DCo), tamanho de fruto (TFr), incidência de cercosporiose (Cer) e incidência de ferrugem (Fer). Foram analisados os efeitos de cada marcador SNP associado com as características de interesse e, dessa forma, esses marcadores poderão ser usados, posteriormente, na seleções assistidas por marcadores moleculares (SAM). Esse foi o primeiro trabalho de GWAS para essas características agronômicas em C. arabica e apresentou resultados promissores para os programas de melhoramento da espécie, confirmando a eficiência da metodologia. Palavras-chave: Melhoramento do Cafeeiro. Marcadores SNP. Seleção Assistida por Marcadores.Item Diversidade genética e resistência de Coffea canephora à ferrugem e à antracnose dos frutos verdes(Universidade Federal de Viçosa, 2019-02) Gonzales, Rafael Vago; Zambolim, LaércioO café Conilon (Coffea canephora) é o principal produto do agronegócio do Estado do Espírito Santo, onde a maior parte dos genótipos cultivados é oriunda de cruzamentos espontâneos e seleção realizada de forma empírica por produtores e viveiristas. São escassos estudos científicos sobre diversidade genética e resistência à doenças nestes materiais. O presente trabalho avaliou a diversidade genética em uma população composta por 124 genótipos de C. canephora, a partir da amplificação de 12 marcadores moleculares do tipo SSR, seguida de eletroforese em gel de poliacrilamida e coloração do gel em solução de nitrato de prata para avaliação dos loci polimórficos. Foi obtida a matriz de distância genética pelo método do complemento, com índice ponderado, a qual foi utilizada para análise de agrupamento pelo método UPGMA. Por meio da amplificação de marcadores SSR, SCAR e CAP, foram identificados, em uma população de 75 indivíduos, genótipos portando marcadores associados aos genes SH3 e QTL de resistência à ferrugem e ao gene Ck-1, que confere resistência ao CBD. Também foi realizada avaliação do nível de resistência às raças II e XXXIII de Hemileia vastatrix em 23 genótipos, sendo feita inoculação artificial em discos foliares e avaliação dos componentes de resistência período de incubação, período latente, % de discos com sintomas, % de discos com esporulação, % de área com sintomas e produção de uredósporos. Foi utilizado delineamento inteiramente casualizado, com 3 repetições por tratamento, cada uma composta por uma caixa gerbox contendo 16 discos foliares. Os dados dos componentes de resistência foram submetidos à análise de variância à 1% de significância. Variáveis que apresentaram diferença significativa foram submetidas ao teste de agrupamento de médias univariado Scott-Knott à 5% de probabilidade. Foi também aplicada estatística multivariada aos componentes, sendo obtida a Distância Generalizada de Mahalanobis entre os pares dos genótipos avaliados e análise de agrupamento utilizando UPGMA. Foram obtidos, pela análise de diversidade, adotando-se o critério de Mojena, com ponto de corte em 0,5552, sete grupos distintos, separando indivíduos com características das variedades Conilon, Robusta e híbridos. Genótipos oriundos do programa de melhoramento do Incaper e materiais oriundos de seleção empírica realizada no Estado do Espírito Santo foram alocados no mesmo grupo, sendo classificados dentro da variedade conilon, enquanto genótipos oriundos de outros programas de melhoramento e outros estados foram alocados em grupos diferentes. Foram identificados sete indivíduos portando marcadores associados ao gene SH3, 61 portando marcadores associados à QTL de resistência à ferrugem e 44 ao gene Ck1. Houveram diferenças significativas entre os genótipos avaliados para todas as componentes de resistência às raças II e XXXIII de H. vastatrix, formando-se, através da análise multivariada, cinco classes de resistência às respectivas raças, sendo elas: Resistentes, Moderadamente Resistentes, Moderadamente Suscetíveis, Suscetíveis e Imunes. Genótipos oriundos de seleção empírica podem constituir importante fonte de germoplasma em programas de melhoramento buscando a hibridação entre as variedades Conilon e Robusta e também buscando resistência à ferrugem e ao CBD. Existe diversidade na população avaliada para o nível de resistência às raças II e XXXIII de H. vastatrix, podendo estes materiais ser utilizados em estratégias de manejo da ferrugem, como controle genético e multilinhas.Item Estudo de associação genômica ampla (GWAS) em Coffea canephora(Universidade Federal de Viçosa, 2018-08-02) Silva, Letícia de Faria; Sakiyama, Ney SussumuEstudos de associação genômica ampla (GWAS) tem sido tradicionalmente utilizados para a identificação de locos de interesse responsáveis pela variação fenotípica. A utilização desse tipo de metodologia explora as ligações mais próximas existentes entre os marcadores moleculares e regiões cromossômicas de interesse para um maior entendimento das características fenotípicas da espécie em estudo, propiciando a identificação de marcas a serem utilizadas em seleções assistidas por marcadores moleculares (SAM) nos programas de melhoramento. Nesse contexto, a utilização dessa metodologia visando um maior entendimento de caracteres morfoagronomicos em um menor período de tempo se mostra uma solução viável para programas de melhoramento de espécies com longo ciclo de vida (plantas perenes) como o café. Assim, o objetivo do trabalho foi identificar regiões cromossômicas com associações significativas em populações de C. canephora em melhoramento para as principais características fenotípicas de importância para essa espécie, através da metodologia de Associação Genômica Ampla (GWAS). A população em estudo foi composta por 165 genótipos contendo os dois grupos varietais Conilon e Robusta além dos Híbridos provenientes desse cruzamento. Foram avaliadas oito características morfoagronomicas sendo elas altura da planta, vigor vegetativo, incidência a cercosporiose, incidência a ferrugem, diâmetro da copa, produtividade, época de maturação dos frutos e tamanho dos frutos. Os cafeeiros foram genotipados com marcadores SNP, distribuídos em todo o genoma. Foram realizadas análises de qualidade (MAF ≥0,01 e CR ≥ 90%) que resultaram em 17.885 SNP. Após a aplicação da metodologia de GWAS, foram identificados marcadores SNP com associações significativas para cinco características (altura da planta, diâmetro da copa, vigor vegetativo, incidência a ferrugem e a cercoporiose). As análises também permitiram a identificação de genes candidatos, nos quais, os marcadores SNP estavam inseridos. Foi possível também relacionar a função dos genes candidatos a característica nos quais esses se encontravam inseridos. Foi possível a identificação da presença dos genes 08-g11560, 10-g16500, 11-g17430, 00-g17460 e 02- g38180 nas duas principais doenças do cafeeiro. Os marcadores SNP com associações significativas se mostraram distribuídos em todo o genoma da espécie e estavam presentes em todos os cromossomos. Com destaque para os cromossomos 0,2,6,9 e 11. Por fim, a metodologia se mostrou eficiente em populações C.canephora, os genes candidatos encontrados inseridos nos marcadores SNP com associações significativas poderão ser avaliados com maior detalhamento e posteriormente poderão ser usados em seleções assistidas por marcadores moleculares (SAM) auxiliando programas de melhoramento da espécie.Item Diversidade genética, ganhos com seleção e seleção genômica ampla na espécie Coffea arabica(Universidade Federal de Viçosa, 2017-08-28) Sousa, Tiago Vieira; Caixeta, Eveline TeixeiraA espécie Coffea arabica é a mais importante, economicamente, do gênero Coffea. Essa espécie é autógama e apresenta base genética estreita. Assim, o sucesso dos programas de melhoramento para essa cultura é desafiador. Nesse sentido, métodos seletivos robustos e precisos são necessários para maximizar os ganhos com seleção, mantendo a variabilidade genética presente nas populações. O uso de marcadores moleculares, por permitir o acesso à informação do DNA dos indivíduos, e da seleção baseada em dados fenotípicos por meio de procedimentos de modelos mistos (REML/BLUP), por permitirem a estimação de parâmetros genéticos de forma acurada mesmo em situação de experimentos desbalanceados, têm se mostrado vantajosos. Finalmente, os métodos de seleção genômica ampla (GWS), que buscam conhecer as associações entre os dados genotípicos e os fenotípicos, tem se mostrado acurado e promissor para diversas espécies vegetais, inclusive para espécies perenes. O objetivo do trabalho foi identificar marcadores SNP e validá-los em estudos de diversidade genética; estimar os parâmetros genéticos e os ganhos com a seleção utilizando a metodologia de modelos mistos (REML/BLUP); aplicar o princípio da GWS e avaliar sua eficiência em população de C. arabica. A população em estudo, inicialmente, foi composta por 72 genótipos nos quais os marcadores SNP foram identificados e validados. A seleção fenotípica, por meio do procedimento REML/BLUP, foi realizada em 228 genótipos de cafeeiros. A GWS foi realizada em população composta por 195 genótipos, genotipados com 21.211 e fenotipados para 18 características agronômicas. Um total de 40.000 sondas específicas foram construídas, sendo identificados 91.517 marcadores SNP em 72 indivíduos de C. arabica. Após análises de qualidade, 11.187 SNP foram selecionados e validados em análises de diversidade e estrutura genética dexv populações. Os marcadores foram eficientes na avaliação da diversidade e estrutura genética de C. arabica. Com base nos dados fenotípicos por meio de análises de modelos mistos foi possível estimar os parâmetros genéticos da população avaliada e obter ganhos expressivos com seleção. Os resultados da GWS demonstram o potencial dessa metodologia seletiva para o melhoramento de C. arabica, por predizer com acurácia os valores genéticos genômicos dos indivíduos e possibilitar a redução no tempo necessário para completar o ciclo de seleção, proporcionando ganhos significativos em eficiência seletiva.Item Seleção assistida por marcadores moleculares para resistência múltipla à ferrugem e à antracnose dos frutos do cafeeiro(Universidade Federal de Viçosa, 2013-07-23) Alkimim, Emilly Ruas; Caixeta, Eveline TeixeiraMarcadores moleculares intimamente ligados a dois genes maiores (S H 3 e S H ?) que conferem resistência à ferrugem, e marcadores moleculares ligados ao gene Ck-1 que confere resistência à antracnose dos frutos do cafeeiro também conhecida por Coffee Berry Disease (CBD), foram previamente identificados. Estes marcadores apresentam potencial para serem usados em programas de melhoramento visando identificar e monitorar genótipos contendo genes de resistência a esses patógenos (Hemileia vastatrix e Colletotrichum kahawae). Dessa forma, o objetivo do trabalho foi utilizar a estratégia de seleção assistida por marcadores moleculares associados aos genes S H 3 (proveniente de Coffea liberica), S H ? (proveniente do Híbrido de Timor-UFV 443-03) e Ck-1, no programa de melhoramento do cafeeiro da Empresa de Pesquisa Agropecuária de Minas Gerais (Epamig)/Universidade Federal de Viçosa (UFV). Inicialmente os marcadores moleculares disponíveis na literatura foram validados e então utilizados na seleção assistida de 160 genótipos. Esses cafeeiros fazem parte do germoplasma da UFV/Epamig e foram introduzidos do CIFC por serem potencialmente portadores de resistência à ferrugem. Por meio dos marcadores validados foi possível identificar onze indivíduos resistentes homozigotos para o gene S H 3, UFV311-48 (F 2 ), UFV311-49 (F 2 ), UFV 311-56 (F 2 ), UFV313-133 (F 2 ), UFV329-72 (F 2 ), UFV329-78 (F 2 ), UFV334-65 (F 2 ), UFV335-12 (F 2 ), UFV335-77 (F 2 ), UFV399-45 (F 2 ) e UFV409-08 (F 2 ). O gene S H 3 confere resistência a diferentes raças de H. vastatrix e a sua incorporação em variedades de interesse tem sido sugerida como importante estratégia para obter resistência à ferrugem. Também foram identificados cafeeiros que além se serem portadores do gene S H 3 em homozigose, apresentaram o gene S H ? proveniente do Híbrido de Timor (UFV443-03). Tais genótipos são o UFV311-48 (F 2 ), UFV311-49 (F 2 ), UFV 311-56 (F 2 ), UFV313-133 (F 2 ), UFV334-65 (F 2 ), UFV399-45 (F 2 ) e UFV409-08 (F 2 ). Para o gene Ck-1 que confere resistência à CBD, foi observado que o genótipo UFV328-60 (F 2 ) foi homozigoto resistente quando analisado com os dois marcadores, apesar de não apresentar bandas ligadas aos genes S H 3 e S H ?. Entretanto UFV317-12 (F 1 ) se mostrou resistente heterozigoto com o marcador CBD-Sat235 (marcador do Ck-1) e resistente homozigoto com o marcador CBD-Sat207 (outro marcador do Ck-1), e portador do gene S H ? que confere resistência à ferrugem. Logo, por meio da Seleção Assistida por Marcadores Moleculares foram identificados cafeeiros portadores de diferentes genes de resistência à ferrugem e à CBD. Esse germoplasma, apesar de ser derivado de C. liberica, apresentou além do gene S H 3 o gene S H ?, até então identificado apenas em genótipos derivados de C. canephora. Os cafeeiros identificados poderão ser utilizados em cruzamentos para a introdução desses genes em outros materiais genéticos de interesse nos programas de melhoramento. A utilização dos marcadores moleculares validados, nos programas de melhoramento, serão imprescindíveis para monitoramento dos genes nas diferentes gerações e cruzamentos.Item Marcadores microssatélites em estudo de diversidade, mapeamento genético e análises de QTLs em Coffea canephora(Universidade Federal de Viçosa, 2013-02-05) Ferrão, Luís Felipe Ventorim; Caixeta, Eveline TeixeiraO uso de marcadores moleculares em estudos genético apresenta-se como uma técnica potencialmente capaz de auxiliar no melhoramento genético de Coffea canephora. Neste contexto, os marcadores microssatélites (SSR) tem sido preferencialmente escolhidos, pois agregam qualidades importantes, dentre as quais se destacam a reprodutibilidade, altos níveis de polimorfismos, expressão codominante e multialelismos. Em programas de melhoramento genético essa tecnologia pode ser utilizada para diferentes finalidades com destaque para os estudos de diversidade genética, que auxiliam na avaliação dos recursos genéticos disponíveis e seleção de potenciais genitores; e nas análises de QTLs, que permitem a elucidação do caráter quantitativo e utilização dessas informações em programas de seleção assistida por marcadores (SAM) e clonagem posicional de genes. Neste sentido o presente trabalho teve como objetivo geral demonstrar a aplicação dos marcadores microssatélites em estudos de diversidade, mapeamento genético e análises de QTLs em C. canephora. Nos estudos de diversidade genética, apresentados no capítulo 1, o resultado da codificação de dados nas avaliações de germoplasma foi mensurado e observou-se uma perda significativa de informações genéticas, o que influencia no manejo e caracterização dos recursos genéticos armazenados nas coleções. Para os estudos de mapeamento e análises de QTLs, apresentados no capítulo 2, os marcadores SSR foram utilizados para a construção do mapa de ligação genético e identificação de fatores genéticos associados à resistência à ferrugem (Hemileia vaxtatrix), que atualmente é a principal doença foliar do cafeeiro. Neste estudo, progênies de irmãos completos de uma população de melhoramento do Incaper (Instituto Capixaba de Pesquisa, Assistência Técnica e Extensão Rural) foram genotipadas e fenotipadas, considerando componentes de resistência avaliados em campo e em laboratório. O resultado do mapeamento de QTL foi a identificação, no grupo de ligação 1, de QTLs significativos para todas as características consideradas no estudo, o que tornou essa região genômica potencialmente útil em estudos de clonagem posicional ou SAM, em programas de melhoramento genético. Por fim, visto a importância dos marcadores moleculares nos estudos com cafeeiros, no capítulo 3, foi descrito um conjunto de 101 novos primers SSRs, minerados de sequencias expressas (EST) do Projeto Brasileiro do Genoma Café. O nível de polimorfismos, a taxa de transferabilidade e sua aplicação em estudos de caracterização molecular e mapeamento genético dentro do gênero Coffea foram considerados e mostrou que os EST-SSR descritos são ferramentas de grande valia para estudos genéticos com cafeeiros. Dessa forma, os resultados obtidos nesse estudo são importantes para os estudos genéticos dentro da espécie, uma vez que foram disponibilizados conhecimentos importantes que tangem o manejo de germoplasmas, seleção de genótipos resistentes à ferrugem, diversidade genética e seleção assistida por marcadores moleculares.Item Caracterização de seqüências expressas do genoma café potencialmente relacionadas com a resistência a doenças(Universidade Federal de Viçosa, 2007-07-16) Alvarenga, Samuel Mazzinghy; Sakiyama, Ney SussumuSeqüências potencialmente envolvidas na resistência do cafeeiro a doenças foram identificadas, por meio de análise in silico, a partir das informações geradas pelo Projeto Brasileiro do Genoma Café (PBGC). Para isso foram usadas três estratégias. Inicialmente, palavras-chave correspondentes a termos relacionados aos mecanismos de resistência de plantas a patógenos foram identificadas na literatura e utilizadas como “iscas” para a mineração dos dados. Com o auxílio de ferramentas disponíveis na plataforma de bioinformática do PBGC, foram identificadas ESTs (Expressed Sequence Tags) relacionadas a cada uma destas palavras. Outra estratégia utilizada foi a busca por similaridades entre algumas seqüências públicas envolvidas com a resistência do cafeeiro a doenças com as seqüências do PBGC, por meio do programa BLAST. Utilizou-se, também, o Electronic Northern, uma ferramenta desenvolvida pelo Laboratório de Genômica e Expressão (LGE). A mineração, usando as três estratégias, identificou 14.060 seqüências do PBGC. Essas seqüências apresentaram similaridade com proteínas conhecidamente relacionadas com o processo de defesa da planta contra doenças como, por exemplo, quitinase, proteína quinase, citocromo P450, proteína de resistência a doenças, proteína relacionada com patogênese, proteínas com domínio LRR e NBS, proteínas induzidas por hipersensibilidade, entre outras. Os processos biológicos com os quais essas seqüências estão envolvidas incluíram metabolismo, transporte, regulação da transcrição, enovelamento de proteínas, biossíntese entre outros. A análise global baseada em ontologia de função molecular das seqüências obtidas mostrou que os genes estão envolvidos com metabolismo, resposta a estímulos externos, diferenciação celular, ligação a ácidos nucléicos, ligação a nucleotídeos, resposta de defesa, apoptose entre outras. Visando verificar o envolvimento destas seqüências com a resistência do cafeeiro à ferrugem foram desenhados 40 primers para amplificar algumas das seqüências mineradas. Os primers foram desenhados com o programa computacional Primer3 e a estabilidade desses foi verificada por meio do programa PrimerSelect. Diferentes concentrações dos componentes da reação de PCR foram analisadas. Utilizando as condições de reação e amplificação otimizadas, os 40 primers foram testados em 12 genótipos resistentes e 12 susceptíveis a Hemileia vastatrix, fungo causador da ferrugem. Vinte e nove destes 40 primers resultaram em bandas únicas e bem definidas, sendo um polimórfico. Este trabalho permitiu obter, até o momento, um marcador molecular polimórfico entre os indivíduos resistentes e susceptíveis. Esse marcador, denominado CARF 005, amplifica uma região do DNA que corresponde a uma ORF parcial de Coffea arabica que codifica uma proteína de resistência a doenças.