Teses e Dissertações
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Item Identificação e caracterização de análogo de gene de resistência (RGA) envolvido na interação cafeeiro-Hemileia vastatrix(Universidade Federal de Viçosa, 2020-02-17) Castro, Isabel Samila Lima; Caixeta, Eveline Teixeira; Zambolim, Laércio; Mendes, Tiago Antônio de OliveiraA ferrugem do cafeeiro, causada pelo fungo biotrófico Hemileia vastatrix, é considerada a principal doença dessa cultura, sendo responsável por perdas na ordem de 30 a 50% da produção, caso medidas de prevenção e controle não sejam adotadas. Apesar da eficiência dos fungicidas, o uso de variedades resistentes é a melhor alternativa para o controle da doença por ser eficiente, econômico e sustentável. No entanto, a obtenção de cultivares com resistência durável tem sido um constante desafio para os melhoristas, devido ao surgimento de novas raças do patógeno capazes de suplantar a resistência. Embora o processo infeccioso de H. vastatrix seja bem compreendido, informações acerca da interação com o hospedeiro são escassas. Estudos de genômica funcional tem contribuído para o entendimento dos mecanismos moleculares envolvidos na interação planta-patógeno, assim como para a identificação de genes codificadores de proteínas envolvidas nas vias de resposta de defesa da planta. Sendo assim, o objetivo desse trabalho foi a identificação e caracterização de um Análogo de Gene de Resistência (Resistance Gene Analog - RGA) potencialmente envolvido na resposta de defesa do cafeeiro à H. vastatrix raça XXXIII. Para isso, um RGA candidato foi selecionado a partir de dados do transcriptoma da interação cafeeiro-H. vastatrix raça XXXIII, com o potencial envolvimento no mecanismo de defesa da planta. A análise de expressão gênica do RGA mostrou diferença significativa entre variedades resistente e suscetível. Foi realizado o rastreamento do RGA em uma biblioteca de clones BAC (Bacterial Artificial Chromosome) obtida do Híbrido de Timor (HdT) CIFC 832/2. O sequenciamento do clone BAC e a sua análise estrutural revelou um loco gênico altamente similar a um loco do genoma de Coffea arabica. Foram identificados três RGAs e as análises de filogenia utilizando esses genes confirmaram a similaridade dessa região com os genomas disponíveis de C. arabica. Para identificar qual dos três RGAs possui importância na resposta de defesa do cafeeiro à H. vastatrix, primers específicos para cada RGA foram construídos e utilizados para amplificação de DNA de cafeeiros diferenciadores de raças de H. vastatrix e para análises de expressão gênica em genótipos resistentes e suscetíveis. Os três RGAs foram amplificados em todos os cafeeiros diferenciadores de raças. Assim, a diferença entre os genótipos resistentes e suscetíveis poderia estar no nível de expressão desses genes. Análises de expressão mostraram que o RGA4 possivelmente é o gene que mantém a função envolvida com a resistência do cafeeiro à H. vastatrix raça XXXIII. Além disso, os resultados de expressão corroboram com a ideia de resistência pré-haustorial sugerida para a mesma interação. Palavras-chave: Bioinformática. Ferrugem do cafeeiro. Fungos fitopatogênicos. Relações hospedeiro-parasito. Resistência.Item Identificação de genes que codificam potenciais proteínas efetoras envolvidas no patossistema Hemileia vastatrix - cafeeiro(Universidade Federal de Viçosa, 2016-02-16) Castro, Isabel Samila Lima; Caixeta, Eveline TeixeiraA ferrugem do cafeeiro é causada pelo fungo Hemileia vastatrix. Trata-se de um parasita biotrófico que infecta apenas o cafeeiro sendo responsável por grandes perdas na produção. Apesar da eficiência dos fungicidas, o emprego de cultivares resistentes é o melhor método de controle, sendo econômico, eficiente, além de não causar impactos ambientais. O grande desafio para os melhoristas é o surgimento de novas raças do patógeno capazes de suplantar a resistência das cultivares resistentes desenvolvidas. A raça XXXIII de H. vastatrix foi recentemente identificada no Brasil, infectando algumas cultivares resistentes à ferrugem do cafeeiro. Durante a interação com a planta hospedeira, os fungos causadores de ferrugem secretam um arsenal de proteínas efetoras que modificam a estrutura e a função da célula hospedeira, permitindo o estabelecimento (ou não) da colonização do parasita. Dessa forma, objetivou-se com esse trabalho, caracterizar genes que codificam proteínas secretadas pelo fungo, por meio de análises de bioinformática e de expressão temporal de genes, que podem funcionar como proteínas efetoras de H. vastatrix (raça XXXIII), a fim de auxiliar a compreensão do processo infeccioso do patógeno. Dentre os 615 genes candidatos a efetores, obtidos a partir de um genoma de referência do fungo, a grande maioria, 376 e 88, apresentaram similaridade com as proteínas de Puccinia sp e Melampsora larici-populina, respectivamente. Utilizando o software BLAST2GO, foi realizada a categorização funcional desses genes. A partir dos resultados do BLASTp, foram extraídos 310 termos GO, distribuídos em três categorias. A categoria mais representada foi “Função Molecular” com 137 termos, seguida por “Processos Biológicos”, 126 termos, e “Componente Celular”, 47 termos. De acordo com a anotação de Enzyme Codes (EC) obtida, as classes enzimáticas mais representadas foram as hidrolases, transferases e as oxidurredutases. Foram selecionados 13 genes para a análise de expressão temporal. A analise foi efetuada pela técnica de PCR em tempo real (RT-PCR), nos tempos 12, 24, 48 e 72 horas após a inoculação (hai) de urediniósporos frescos em plantas de cafeeiro resistente (CIFC 832-1) e suscetível (Caturra) à ferrugem. Foi possível obter quatro padrões diferentes de expressão. Tais padrões sugerem que os genes analisados possam estar envolvidos na tentativa de sobrevivência do fungo em resposta a resistência da planta, na fase biotrófica da infecção, além de genes relacionados com a supressão da resposta de defesa da planta durante a penetração, no reconhecimento do hospedeiro e/ou na fase inicial da colonização. Os resultados indicaram que pode ocorrer comunicação entre o fungo e o hospedeiro, logo no início da infecção, ainda na fase de germinação dos esporos. Estudos biológicos funcionais deverão ser realizados para determinar a verdadeira função desses efetores durante a interação de H. vastatrix com o cafeeiro. Essas informações são úteis para os estudos que visam o entendimento dos mecanismos moleculares envolvidos na suplantação da resistência por novas raças do fungo, fornecendo subsídios para o desenvolvimento de cultivares com resistência durável.