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Item Identificação e caracterização de análogo de gene de resistência (RGA) envolvido na interação cafeeiro-Hemileia vastatrix(Universidade Federal de Viçosa, 2020-02-17) Castro, Isabel Samila Lima; Caixeta, Eveline Teixeira; Zambolim, Laércio; Mendes, Tiago Antônio de OliveiraA ferrugem do cafeeiro, causada pelo fungo biotrófico Hemileia vastatrix, é considerada a principal doença dessa cultura, sendo responsável por perdas na ordem de 30 a 50% da produção, caso medidas de prevenção e controle não sejam adotadas. Apesar da eficiência dos fungicidas, o uso de variedades resistentes é a melhor alternativa para o controle da doença por ser eficiente, econômico e sustentável. No entanto, a obtenção de cultivares com resistência durável tem sido um constante desafio para os melhoristas, devido ao surgimento de novas raças do patógeno capazes de suplantar a resistência. Embora o processo infeccioso de H. vastatrix seja bem compreendido, informações acerca da interação com o hospedeiro são escassas. Estudos de genômica funcional tem contribuído para o entendimento dos mecanismos moleculares envolvidos na interação planta-patógeno, assim como para a identificação de genes codificadores de proteínas envolvidas nas vias de resposta de defesa da planta. Sendo assim, o objetivo desse trabalho foi a identificação e caracterização de um Análogo de Gene de Resistência (Resistance Gene Analog - RGA) potencialmente envolvido na resposta de defesa do cafeeiro à H. vastatrix raça XXXIII. Para isso, um RGA candidato foi selecionado a partir de dados do transcriptoma da interação cafeeiro-H. vastatrix raça XXXIII, com o potencial envolvimento no mecanismo de defesa da planta. A análise de expressão gênica do RGA mostrou diferença significativa entre variedades resistente e suscetível. Foi realizado o rastreamento do RGA em uma biblioteca de clones BAC (Bacterial Artificial Chromosome) obtida do Híbrido de Timor (HdT) CIFC 832/2. O sequenciamento do clone BAC e a sua análise estrutural revelou um loco gênico altamente similar a um loco do genoma de Coffea arabica. Foram identificados três RGAs e as análises de filogenia utilizando esses genes confirmaram a similaridade dessa região com os genomas disponíveis de C. arabica. Para identificar qual dos três RGAs possui importância na resposta de defesa do cafeeiro à H. vastatrix, primers específicos para cada RGA foram construídos e utilizados para amplificação de DNA de cafeeiros diferenciadores de raças de H. vastatrix e para análises de expressão gênica em genótipos resistentes e suscetíveis. Os três RGAs foram amplificados em todos os cafeeiros diferenciadores de raças. Assim, a diferença entre os genótipos resistentes e suscetíveis poderia estar no nível de expressão desses genes. Análises de expressão mostraram que o RGA4 possivelmente é o gene que mantém a função envolvida com a resistência do cafeeiro à H. vastatrix raça XXXIII. Além disso, os resultados de expressão corroboram com a ideia de resistência pré-haustorial sugerida para a mesma interação. Palavras-chave: Bioinformática. Ferrugem do cafeeiro. Fungos fitopatogênicos. Relações hospedeiro-parasito. Resistência.Item Caracterização de raças fisiológicas e análise de proteínas candidatas a efetoras em população de Hemileia vastatrix no Brasil(Universidade Federal de Viçosa, 2017) Silva, Rosemeire Alves; Zambolim, LaércioA ferrugem do cafeeiro, causada pelo fungo Hemileia vastatrix Berkeley & Broome, é considerada a principal doença da cultura. O fungo está amplamente distribuído nas regiões produtoras de café, causando severos danos econômicos. Novas raças fisiológicas de H. vastatrix tem surgido, com frequência em todo mundo, infectando algumas cultivares de café lançadas comercialmente como resistentes à ferrugem. Dessa forma, a obtenção de cafeeiros resistentes tem sido um desafio devido ao alto potencial adaptativo do fungo e tem se tornado cada vez mais difícil a caracterização dos patótipos por meio da coleção de cafeeiros diferenciadores de raça. Além disso, as informações acerca da interação de cafeeiros com as raças existentes são escassas, embora o processo infeccioso de H. vastatrix seja bem estudado. Estudos genômicos estão ajudando no entendimento dos mecanismos moleculares envolvidos no processo de interação entre planta e patógeno e no desenvolvimento de técnicas moleculares para a identificação de isolados. Nosso objetivo foi caracterizar as raças de H. vastatrix encontradas nas principais regiões produtoras de café do Brasil, e estudar as proteínas candidatas a efetoras preditas para H. vastatrix que possam contribuir para patogenicidade nas diferentes raças do fungo. Foram utilizados 56 isolados monopustular coletados de diferentes espécies de café, Coffea canephora, C. arabica e Híbrido de Timor (C. canephora x C. arabica) e multiplicados em cafeeiro suscetível C. arabica variedade Caturra. Cada isolado foi inoculado em cafeeiros que compõe a série diferenciadora de raças, com três repetições. O DNA dos 56 isolados monopustulares foram extraídos para os estudos genômico. Foram utilizadas 47 combinações de primer para amplificar genes de candidatos a efetores. Sete genes foram amplificados, sequenciados e tiveram sua expressão validada em cafeeiros resistente e suscetível. As sequências obtidas foram alinhadas para os 46 isolados, usando o programa DNA Baser. Estudo de domínio conservado foram realizados no programa Pfam e a categorização das proteínas no Blast2GO. O alinhamento das sequências de nucleotídeos, proteínas e agrupamento dos isolados foi feito no programa Clustalw e as diferença de nucleotídeo foi analisada no Weblogo. Os dados obtidos foram usados para o estudo de diversidade. Por meio da inoculação na série diferenciada, foram identificadas sete raças, sendo cinco já descritas no Brasil e duas pela primeira vez (raça XXIX e XXX). Não foi possível caracterizar 15 combinações dos genes de virulência, sendo assim consideradas novas raças. A análise da coleção de isolados permitiu inferir a presença de pelo menos seis novos genes na série diferenciadora, o que possibilitou diferenciar dois isolados descritos como raças III. Na análise genômica, os 47 genes candidatos a efetores estudados se mostraram conservados em todos os isolados e estão ligados a 15 processos biológicos do desenvolvimento do fungo. Foram identificados 14 domínios nas proteínas provenientes desses genes. Para os sete genes sequenciados nos diferentes isolados, observou-se diferença na sequência dos nucleotídeos e presença de indivíduos heterozigoto e homozigoto. Com análise de diversidade foi possível discriminar os indivíduos, sendo o isolado Hv-09 o mais divergente. As informações geradas nesta pesquisa poderão ampliar o entendimento da interação entre H. vastatrix e o cafeeiro. O conhecimento dos genes que estão envolvidos no processo infeccioso auxiliará o entendimento dos mecanismos moleculares que levam à suplantação da resistência por novas raças do fungo.