COLETA DE FOLHAS DO CAFEEIRO E EXTRAÇÃO DE DNA GENÔMICO DE ALTA QUALIDADE

Abstract

Para a amplificação do DNA in vitro, é necessário que o DNA genômico seja de boa qualidade. É comum que seja realizada a coleta do tecido vegetal em local distante de onde será feita a extração e análises do DNA e muitas vezes, o armazenamento inadequado das amostras favorece as reações de oxidação, resultando na redução da qualidade deste. Realizou-se este trabalho com o objetivo de estabelecer um método simples e eficiente para coleta e armazenamento de folhas de Coffea arabica visando a obtenção de DNA de boa qualidade. O trabalho foi realizado no Laboratório de Análise de Sementes da Universidade Federal de Lavras, envolvendo doze tratamentos e duas testemunhas. Foram combinados os fatores umidade da folha (seca ou úmida) x tempo de armazenamento (24h e 48h) x condição do ambiente (ToC ambiente ou 4oC) x utilização de sílica no recipiente de armazenamento da folha (com ou sem sílica). Foram utilizados dois controles, onde as folhas coletadas foram armazenadas no campo em gelo ou em N2 líquido e submetidas à extração do DNA logo após a sua coleta. A avaliação da qualidade do DNA foi feita pela eletroforese do DNA genômico em gel de agarose 0,7% e pela amplificação de fragmentos de DNA utilizando-se um par de primer microssatélite. Os resultados indicaram que a utilização da sílica quando as folhas estavam secas e o armazenamento das folhas a 4oC por 24h ou 48 h são favoráveis à oxidação das amostras, resultando em um DNA de má qualidade. A extração do DNA de alta qualidade passível de ser utilizado em PCR é viável quando folhas secas ou úmidas são coletadas e armazenadas em sacos plásticos por até 48 horas antes do início do procedimento da extração.

A genomic DNA with high quality is necessary to DNA in vitro amplification. It is usual the harvesting of vegetal tissue in a place distant from the laboratory where the DNA extraction and analysis will be done. Also, the inappropriate storage of samples contributes to oxidation reactions, reducing the DNA quality. This work aimed to determine a simple and efficient process for harvest and storage of Coffea arabica leaves to obtain a DNA with high quality. The experiment was conducted in Seed Analysis Laboratory at Lavras Federal University with 12 treatments. Were combined leaf moisture (dry and wet) x storage period (24h and 48h) x environment temperature (T°C environment and 4°C) x silica gel within leaf storage bag. Were used two controls with the leaves harvested and after this, stored next to ice or in liquid N 2 and immediately take to the laboratory for the DNA extraction. The DNA quality analysis was done by the agarose gel electrophoresis for the genomic DNA and by the amplification of DNA fragments using a microsatellite primer. To use silica gel when the leaves are dry and the leaves storage at 4°C by 24h or 48h contributes to sample oxidation and results in a bad quality of DNA. The high quality DNA is obtained when dry or wet leaves are harvested and stored in bags until 48 hours before the beginnings of extraction procedure.