Padronização de metodologia para mensuramento do conteúdo de DNA de cada cromossomo de Coffea canephora via citometria de imagem

Abstract

O Brasil lidera o mercado mundial de café em produção e exportação e é o segundo maior consumidor do grão. Parte desse aumento tem sido atribuída aos investimentos em programas de melhoramento e às inovações geradas pelos processos biotecnológicos. Espécies do gênero Coffea têm sido objetos de estudos citométricos, os quais geram dados de base citológica e genética para contribuir com programas de melhoramento. Entres os vários níveis de contribuição, a citometria de imagem, metodologia que mensura o conteúdo relativo e/ou absoluto de DNA por meio do cálculo da densidade óptica integrada (DOI) de núcleos ou cromossomos corados com reativo de Schiff, fornece informações úteis para o planejamento de projetos de seqüenciamento e estabelecimento de mapas genéticos. O objetivo do presente estudo foi estimar o conteúdo de DNA, em picogramas, para cada cromossomo de C. canephora cv. Apoatã via citometria de imagem. Suspensões de agregados celulares foram tratadas com amiprofos-metil, fixadas e maceradas enzimaticamente. As técnicas de dissociação celular e secagem ao ar foram empregadas no preparo das lâminas, e essas foram hidrolisadas e coradas com reativo de Schiff. As imagens cromossômicas foram capturadas, por meio de microscópio e câmera CCD, e analisadas com recursos digitais de análise de imagem. Os procedimentos metodológicos proporcionaram prometáfases e metáfases contendo cromossomos morfologicamente preservados. Dentre essas imagens mitóticas, foram selecionadas três prometáfases e seis metáfases com cromossomos sem sobreposições e no mesmo plano de foco, estas foram utilizadas na montagem dos cariogramas e no cálculo da DOI. A partir dos valores médios de DOI dos cromossomos e do conteúdo 2C de DNA de C. canephora cv. Apoatã (1,43 pg) foi mensurado o conteúdo de DNA para cada cromossomo, que variou de 0,18 pg (cromossomo 1) a 0,10 pg (cromossomo 11). Os resultados abrangem informações acerca do genoma desta espécie que podem ser úteis em programas de melhoramento, seqüenciamento e em estudos evolutivos.

Brazil leads the world coffee market in production and exportation, and is the second biggest worldwide consumer of the grain. Part of the production increase has been ascribed to the investments on breeding programs and to the innovations brought by the biotechnological processes. Species from the genus Coffea have been under investigation in cytometrical studies, which search for data using cytological and genetical principles in order to contribute with breeding programs. Among its many contributions, the image cytometry, methodology that measures the relative and/or absolute DNA content by calculation of the integrated optical density (IOD) of nuclei and chromosomes stained with the Schiff reaction, supplies useful information for the planning of sequencing projects and establishment of genetic maps. The objective of the present study was to estimate the DNA content, in picograms (pg), for each chromosome of C. canephora cv. Apoatã by image cytometry. Cell suspension aggregates were treated with amiprophos-methyl, fixed and enzymatically macerated. The cellular dissociation and air-drying techniques were used in the preparation of slides, which were subsequently hydrolyzed and stained with the Schiff reaction. The chromosome images were captured, by microscope and CCD camera, and analyzed with digital resources of image analysis. The methodological procedures provided prometaphases and metaphases with morphologically preserved chromosomes. Out of all mitotic images, we selected 3 prometaphases and 6 metaphases with chromosomes showing no overlaps and localized in the same focus plane. The same mitotic images were used in the assembly of karyograms and in the calculation of the IOD. Using the mean IOD values and absolute 2C DNA content of C. canephora cv. Apoatã (1.43 pg), the DNA content for each chromosome could be measured, and varied from 0.18 pg (chromosome 1) to 0.10 pg (chromosome 11). The results include information regarding the genome of this species that can be useful in breeding programs, sequencing and evolutive studies.