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Identificação de genes que codificam potenciais proteínas efetoras envolvidas no patossistema Hemileia vastatrix - cafeeiro
(Universidade Federal de Viçosa, 2016-02-16) Castro, Isabel Samila Lima; Caixeta, Eveline Teixeira
A ferrugem do cafeeiro é causada pelo fungo Hemileia vastatrix. Trata-se de um parasita biotrófico que infecta apenas o cafeeiro sendo responsável por grandes perdas na produção. Apesar da eficiência dos fungicidas, o emprego de cultivares resistentes é o melhor método de controle, sendo econômico, eficiente, além de não causar impactos ambientais. O grande desafio para os melhoristas é o surgimento de novas raças do patógeno capazes de suplantar a resistência das cultivares resistentes desenvolvidas. A raça XXXIII de H. vastatrix foi recentemente identificada no Brasil, infectando algumas cultivares resistentes à ferrugem do cafeeiro. Durante a interação com a planta hospedeira, os fungos causadores de ferrugem secretam um arsenal de proteínas efetoras que modificam a estrutura e a função da célula hospedeira, permitindo o estabelecimento (ou não) da colonização do parasita. Dessa forma, objetivou-se com esse trabalho, caracterizar genes que codificam proteínas secretadas pelo fungo, por meio de análises de bioinformática e de expressão temporal de genes, que podem funcionar como proteínas efetoras de H. vastatrix (raça XXXIII), a fim de auxiliar a compreensão do processo infeccioso do patógeno. Dentre os 615 genes candidatos a efetores, obtidos a partir de um genoma de referência do fungo, a grande maioria, 376 e 88, apresentaram similaridade com as proteínas de Puccinia sp e Melampsora larici-populina, respectivamente. Utilizando o software BLAST2GO, foi realizada a categorização funcional desses genes. A partir dos resultados do BLASTp, foram extraídos 310 termos GO, distribuídos em três categorias. A categoria mais representada foi “Função Molecular” com 137 termos, seguida por “Processos Biológicos”, 126 termos, e “Componente Celular”, 47 termos. De acordo com a anotação de Enzyme Codes (EC) obtida, as classes enzimáticas mais representadas foram as hidrolases, transferases e as oxidurredutases. Foram selecionados 13 genes para a análise de expressão temporal. A analise foi efetuada pela técnica de PCR em tempo real (RT-PCR), nos tempos 12, 24, 48 e 72 horas após a inoculação (hai) de urediniósporos frescos em plantas de cafeeiro resistente (CIFC 832-1) e suscetível (Caturra) à ferrugem. Foi possível obter quatro padrões diferentes de expressão. Tais padrões sugerem que os genes analisados possam estar envolvidos na tentativa de sobrevivência do fungo em resposta a resistência da planta, na fase biotrófica da infecção, além de genes relacionados com a supressão da resposta de defesa da planta durante a penetração, no reconhecimento do hospedeiro e/ou na fase inicial da colonização. Os resultados indicaram que pode ocorrer comunicação entre o fungo e o hospedeiro, logo no início da infecção, ainda na fase de germinação dos esporos. Estudos biológicos funcionais deverão ser realizados para determinar a verdadeira função desses efetores durante a interação de H. vastatrix com o cafeeiro. Essas informações são úteis para os estudos que visam o entendimento dos mecanismos moleculares envolvidos na suplantação da resistência por novas raças do fungo, fornecendo subsídios para o desenvolvimento de cultivares com resistência durável.
Identificação e caracterização de análogo de gene de resistência (RGA) envolvido na interação cafeeiro-Hemileia vastatrix
(Universidade Federal de Viçosa, 2020-02-17) Castro, Isabel Samila Lima; Caixeta, Eveline Teixeira; Zambolim, Laércio; Mendes, Tiago Antônio de Oliveira
A ferrugem do cafeeiro, causada pelo fungo biotrófico Hemileia vastatrix, é considerada a principal doença dessa cultura, sendo responsável por perdas na ordem de 30 a 50% da produção, caso medidas de prevenção e controle não sejam adotadas. Apesar da eficiência dos fungicidas, o uso de variedades resistentes é a melhor alternativa para o controle da doença por ser eficiente, econômico e sustentável. No entanto, a obtenção de cultivares com resistência durável tem sido um constante desafio para os melhoristas, devido ao surgimento de novas raças do patógeno capazes de suplantar a resistência. Embora o processo infeccioso de H. vastatrix seja bem compreendido, informações acerca da interação com o hospedeiro são escassas. Estudos de genômica funcional tem contribuído para o entendimento dos mecanismos moleculares envolvidos na interação planta-patógeno, assim como para a identificação de genes codificadores de proteínas envolvidas nas vias de resposta de defesa da planta. Sendo assim, o objetivo desse trabalho foi a identificação e caracterização de um Análogo de Gene de Resistência (Resistance Gene Analog - RGA) potencialmente envolvido na resposta de defesa do cafeeiro à H. vastatrix raça XXXIII. Para isso, um RGA candidato foi selecionado a partir de dados do transcriptoma da interação cafeeiro-H. vastatrix raça XXXIII, com o potencial envolvimento no mecanismo de defesa da planta. A análise de expressão gênica do RGA mostrou diferença significativa entre variedades resistente e suscetível. Foi realizado o rastreamento do RGA em uma biblioteca de clones BAC (Bacterial Artificial Chromosome) obtida do Híbrido de Timor (HdT) CIFC 832/2. O sequenciamento do clone BAC e a sua análise estrutural revelou um loco gênico altamente similar a um loco do genoma de Coffea arabica. Foram identificados três RGAs e as análises de filogenia utilizando esses genes confirmaram a similaridade dessa região com os genomas disponíveis de C. arabica. Para identificar qual dos três RGAs possui importância na resposta de defesa do cafeeiro à H. vastatrix, primers específicos para cada RGA foram construídos e utilizados para amplificação de DNA de cafeeiros diferenciadores de raças de H. vastatrix e para análises de expressão gênica em genótipos resistentes e suscetíveis. Os três RGAs foram amplificados em todos os cafeeiros diferenciadores de raças. Assim, a diferença entre os genótipos resistentes e suscetíveis poderia estar no nível de expressão desses genes. Análises de expressão mostraram que o RGA4 possivelmente é o gene que mantém a função envolvida com a resistência do cafeeiro à H. vastatrix raça XXXIII. Além disso, os resultados de expressão corroboram com a ideia de resistência pré-haustorial sugerida para a mesma interação. Palavras-chave: Bioinformática. Ferrugem do cafeeiro. Fungos fitopatogênicos. Relações hospedeiro-parasito. Resistência.
Receptor-Like Kinase (RLK) as a candidate gene conferring resistance to Hemileia vastatrix in coffee
(Escola Superior de Agricultura "Luiz de Queiroz", 2021) Almeida, Dênia Pires de; Castro, Isabel Samila Lima; Mendes, Tiago Antônio de Oliveira; Alves, Danúbia Rodrigues; Barka, Geleta Dugassa; Barreiros, Pedro Ricardo Rossi Marques; Zambolim, Laércio; Sakiyama, Ney Sussumu; Caixeta, Eveline Teixeira
The biotrophic fungus Hemileia vastatrix causes coffee leaf rust (CLR), one of the most devastating diseases in Coffea arabica. Coffee, like other plants, has developed effective mechanisms to recognize and respond to infections caused by pathogens. Plant resistance gene analogs (RGAs) have been identified in certain plants as candidates for resistance (R) genes or membrane receptors that activate the R genes. The RGAs identified in different plants possess conserved domains that play specific roles in the fight against pathogens. Despite the importance of RGAs, in coffee plants these genes and other molecular mechanisms of disease resistance are still unknown. This study aimed to sequence and characterize candidate genes from coffee plants with the potential for involvement in resistance to H. vastatrix. Sequencing was performed based on a library of bacterial artificial chromosomes (BAC) of the coffee clone ‘Híbrido de Timor’ (HdT) CIFC 832/2 and screened using a functional marker. Two RGAs, HdT_ LRR_RLK1 and HdT_LRR_RLK2, containing the motif of leucine-rich repeat-like kinase (LRR-RLK) were identified. Based on the presence or absence of the HdT_LRR_RLK2 RGA in a number of differential coffee clones containing different combinations of the rust resistance gene, these RGAs did not correspond to any resistance gene already characterized (SH1-9). These genes were also analyzed using qPCR and demonstrated a major expression peak at 24 h after inoculation in both the compatible and incompatible interactions between coffee and H. vastatrix. These results are valuable information for breeding programs aimed at developing CLR-resistant cultivars, in addition to enabling a better understanding of the interactions between coffee and H. vastatrix.
Regulação transcricional do metabolismo de glicerol-3-fosfato induz resistência à ferrugem do café
(Embrapa Café, 2019-10) Gazolla, Lizandra Cristina de Oliveira Figueiredo; Almeida, Dênia Pires; Castro, Isabel Samila Lima; Castro, Alex Gazolla de; Arruda, Luiz Vinícius de Souza; Vieira, Nívea Maria; Mantovani, Hilário Cuquetto; Zambolim, Laércio; Caixeta, Eveline Teixeira; Mendes, Tiago Antônio de Oliveira
A produção mundial de café tem sido profundamente afetada pela ferrugem do cafeeiro, doença causada pelo fungo biotrófico Hemileia vastatrix. Apesar do Híbrido de Timor 832/2, um híbrido natural de Coffea arabica e C. canephora resistente à ferrugem, ser uma importante fonte de genes para programas de melhoramento genético, o mecanismo associado à resistência incluindo a regulação do metabolismo durante a infecção é pouco conhecido. Reconstruímos o primeiro modelo metabólico em escala genômica (GEM) para café e a análise do balanço de fluxo (FBA), após a integração de dados de transcriptômica, sugeriu o acúmulo de glicerol-3-fosfato (G3P) na via glicolítica do Híbrido de Timor. A quantificação de G3P nos cultivares em estudo confirmou o acúmulo previsto. O tratamento de plantas suscetíveis com glicerol 3% antes da inoculação do fungo aumentou a concentração de G3P e reduziu os sintomas da doença. Esses resultados destacam o G3P e o metabolismo primário de carboidratos como importante via de resistência à ferrugem do cafeeiro.