Embriogênese somática indireta e fusão interespecífica de protoplastos em Coffea

Abstract

Esta pesquisa foi conduzida com o objetivo de verificar a exeqüibilidade da fusão protoplástica interespecífica como ferramenta no melhoramento parassexual em Coffea. Para tanto, pretendeu-se a introgressão das resistências aos nematóides Meloidogyne incognita e M. exigua, do cultivar canéfora Apoatã, nos genótipos arábicas diplóide DH3 e tetraplóides Catimor e Catuaí Amarelo. Com vistas à obtenção dos protoplastos, foi dado início a suspensões celulares embriogênicas a partir de calos friáveis embriogênicos induzidos de explantes foliares. Posteriormente foram estudadas, nas suspensões celulares Apoatã e DH3 , as cinéticas do crescimento e do rendimento protoplástico em função do tempo pós-subcultura, bem como as condições de digestão enzimática da parede celular de seus agregados celulares. Foram realizados, ainda, estudos para a seleção dos heterofusionados. Embora todos os genótipos testados tenham reagido favoravelmente à formação de tecido embriogênico friável, apenas os arábicas DH3 e Catuaí Vermelho requereram a ação conjunta de auxina e citocinina. Os demais Apoatã, Catimor e Catuaí Amarelo reagiram mais favoravelmente quando o regulador de crescimento foi apenas a citocinina BAP. As maiores freqüências de explantes com calos friáveis verificadas para os genótipos canéfora Apoatã e arábicas DH3 , Catimor, Catuaí Amarelo e Catuaí Vermelho foram, respectivamente, 80, 60, 40, 40 e 20%. A diferenciação embriogênica dos agregados celulares, em cultura líquida, rendeu cerca de 241.000, 72.870 e 121.760 embriões g-1 MF de agregados celulares Apoatã, Catimor e DH3 , respectivamente. As suspensões celulares Apoatã e DH3 revelaram, imediatamente após a subcultura, uma fase exponencial de crescimento celular até um ponto de inflexão, a partir do qual as taxas de crescimento reduziram progressivamente para atingir um peso de matéria fresca dos agregados celulares assintótico. Coincidentemente, os menores rendimentos protoplásticos foram observados para tempos pós-subcultura superiores àquele do ponto de inflexão. A pré-plasmólise, a seleção dos agregados celulares de diâmetro inferior a 1 mm e a adição de cisteína 0,83 mM, durante a digestão enzimática, não interferiram no rendimento protoplástico das suspensões celulares Apoatã e DH3 , ao contrário das concentrações das enzimas pectinases e celulase. De maneira geral, o rendimento protoplástico Apoatã, sempre inferior àquele DH3 , foi maior quando as duas pectinases, pectoliase e macerozima, estiveram associadas à celulase, as três nas maiores concentrações testadas. Os 12 meios de cultivo de protoplastos testados não permitiram distinguir os protoplastos parentais Apoatã e DH3 em nível de crescimento dos microcalos. Alternativamente, os inibidores metabólicos iodoacetamida e rodamina, nas respectivas concentrações de 2 e de 0,9 mM, mostraram-se eficazes em inibir a regeneração dos protoplastos parentais em microcalos. Seu aproveitamento permitiu a realização de 23 ensaios de eletrofusão interespecífica, cujos produtos, aparentemente justificados pela complementação metabólica, encontram-se em desenvolvimento com vistas à diferenciação embriogênica e regeneração de plantas. Esta última permitirá análises para verificação do potencial da fusão protoplástica no melhoramento parassexual em Coffea.

The aim of the present work was to evaluate the feasibility of interspecific protoplast fusion as a tool in the parassexual improvement in Coffea. Introgression of nematode resistance from Coffea canephora cv. Apoatã was attempted in diploid (DH3 ) and tetraploid (Catimor and Catuaí Amarelo) C. arabica genotypes by protoplast fusion. Protoplasts were isolated from embryogenic cell suspensions initiated from leaf explants-derived friable embryogenic calli. For Apoatã and DH3 cell suspensions the kinetics of growth and protoplast yield was evaluated as affected by the intervals of subcultures and the conditions of enzymatic digestion of the cell walls of their small cell aggregates. Investigations aiming at selection of protoplast heterofused-derived cell aggregates were also accomplished. All genotypes studied reacted favorably to the formation of friable embryogenic calli. C. arabica genotypes, DH3 and Catuaí Vermelho, however, required the use of both auxin and cytokinin. Conversely, Apoatã, Catimor and Catuaí Amarelo presented similar morphogenetic responses when induction media were supplemented with BAP only. Frequencies of friable embryogenic calli of 80, 60, 40, 40 and 20% were obtained for Apoatã, DH3 , Catimor, Catuaí Amarelo and Catuaí Vermelho, respectively. Embryogenic differentiation from cell aggregates, in liquid culture, produced about 241.000, 72.870 and 121.760 embryos g-1 FW for Apoatã, Catimor and DH3 , respectively. Immediately to the subculture, Apoatã and DH3 cell suspensions revealed a typical sigmoidal growth curve. Coincidentally, the lowest protoplast yields were observed for post-subculture intervals above the inflection point. The pre-plasmolysis, the size of the aggregates (smaller than 1 mm diameter) and the addition of cysteine 0.83 mM, during the enzymatic digestion, did not affect protoplast yield of Apoatã and DH3 cell suspensions, unlike the concentrations of the pectinases and cellulase enzymes. In general, protoplast yields of Apoatã were always inferior to that DH3 . High yields were achieved when the two pectinases (pectolyase and macerozyme) were combined to cellulase, at the highest tested concentrations. The twelve protoplast culture media tested did not allow any distinction between parental protoplasts Apoatã and DH3 , at microcalli growth stages. Alternatively, the metabolic inhibitors iodoacetamide and rhodamine, at the concentrations 2 and 0.9 mM, respectively, were effective in inhibiting microcalli formation from cultured parental protoplasts. Its use allowed the accomplishment of 23 independent interspecific electrofusion assessments whose products led to the development of embryogenic differentiation. Further work will be carried out in order to characterize the putative heterofused regenerants and to examine the potential of somatic hybridization as a tool for parassexual improvement in Coffea.