1 Universidade de São Paulo Escola Superior de Agricultura “Luiz de Queiroz” Desenvolvimento de armadilha de auto-inoculação par a o controle de Hypothenemus hampei (Ferrari, 1867) (Coleoptera: Curculionidae) com Beauveria bassiana (Bals.) Vuil (Ascomycota: Hypocreales) em tecido sintético Luiz Henrique Costa Mota Dissertação apresentada para obtenção do título de Mestre em Ciências. Área de concentração: Entomologia Piracicaba 2013 2 Luiz Henrique Costa Mota Engenheiro Agrônomo Desenvolvimento de armadilha de auto-inoculação par a o controle de Hypothenemus hampei (Ferrari, 1867) (Coleoptera: Curculionidae) com Beauveria bassiana (Bals.) Vuil (Ascomycota: Hypocreales) em tecido sintético Versão revisada de acordo com a resolução CoPGr 601 8 de 2011 Orientador: Prof. Dr. ITALO DELALIBERA JÚNIOR Dissertação apresentada para obtenção do título de Mestre em Ciências. Área de concentração: Entomologia Piracicaba 2013 Dados Internacionais de Catalogação na Publicação DIVISÃO DE BIBLIOTECA - ESALQ/USP Mota, Luiz Henrique Costa Desenvolvimento de armadilha de auto-inoculação para o controle de Hypothenemus hampei (Ferrari, 1867) (Coleoptera: Curculionidae) com Beauveria bassiana (Bals.) Vuil (Ascomycota: Hypocreales) em tecido sintético / Luiz Henrique Costa Mota.- - versão revisada de acordo com a resolução CoPGr 6018 de 2011. - - Piracicaba, 2013. 84 p: il. Dissertação (Mestrado) - - Escola Superior de Agricultura “Luiz de Queiroz”, 2013. 1. Armadilha 2. Broca-do-café 3. Controle biológico 4. Epizootia 5. Fungos entomopatogênicos 6. Semioquímicos I. Título CDD 632.768 M917d “Permitida a cópia total ou parcial deste documento, desde que citada a fonte – O autor” 3 A D eus , A G RA D E ÇO A os m eus pais José L uiz e M iraci A os m eus irm ãos Josim ar e V erônica À m inha avó D eraldina (In m em oriam ) Pelo apoio e incentivo, D E D ICO 4 5 AGRADECIMENTOS A Deus por guiar meus passos em todas as etapas de minha vida. À minha família pelo apoio que me faz a buscar meus objetivos. Ao meu orientador, Prof. Dr. Italo Delalibera Jr., pela orientação, atenção e confiança. À Escola Superior de Agricultura “Luiz de Queiroz”, em especial aos professores e funcionários do Departamento de Entomologia e Acarologia. À Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES), pela concessão da bolsa de estudo. À bióloga Solange Aparecida Vieira Barros, técnica do Laboratório de Patologia e Controle Microbiano de Insetos, pela atenção, paciência e apoio. Ao Prof. Dr. José Maurício Simões Bento, pelas sugestões dadas a esta pesquisa. Ao doutorando Weliton Dias da Silva pelas valiosas contribuições dadas a esta pesquisa. À Profa. Dra. Clarice Garcia Borges Demétrio e a Dra. Renata Alcarde, pelo auxílio nas análises estatísticas. Aos amigos e colegas do curso de Pós-Graduação em Entomologia, em especial a toda equipe do Laboratório de Patologia e Controle Microbiano de Insetos, pelo apoio e convivência. A todos que de alguma forma contribuíram com essa pesquisa, em especial: Gleidyane Mielezrski e Johanna Cuervo (pela ajuda na elaboração das referências), Ana Beatriz Zanardo, Celeste D'Alessandro, Glaucia Moreira e Vanessa Duarte 6 (pelas contribuições na parte escrita), Odimar Zanardi (pela ajuda na confecção dos gráficos), Antônio Bianchi (pelo abstract) e a Janayne Rezende e Giuliano Pauli (pelas sugestões). Aos amigos de república, Gabriel Rugno, Giovani Coura, Marcos Conceschi, Claudio Gladenucci e aos amigos Aloisio Coelho, Vitor Beloti, Rízia Andrade, Fernanda Müller, Fernando Consolaro, pelos almoços e momentos de descontração. A Paulo Barbosa e Danuza Araújo, pelos conselhos e amizade desde a graduação. 7 SUMÁRIO RESUMO................................................................................................................... 11 ABSTRACT ............................................................................................................... 13 1 INTRODUÇÃO ....................................................................................................... 15 2 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA ................................................................................... 17 2.1 Importância de Hypothenemus hampei ............................................................ 17 2.2 Aspectos bioecológicos de Hypothenemus hampei ......................................... 17 2.2.1 Descrição e ciclo de vida de Hypothenemus hampei .................................... 17 2.2.2 Aspectos comportamentais de Hypothenemus hampei ................................ 18 2.3 Controle de Hypothenemus hampei ................................................................. 19 2.3.1 Controle químico ........................................................................................... 19 2.3.2 Controle por comportamento: uso de armadilhas com atraentes químicos para monitoramento e controle de Hypothenemus hampei .................................... 20 2.3.3 Controle biológico ......................................................................................... 21 2.4 Utilização de tecidos sintéticos impregnados com entomopatógenos no controle de pragas ................................................................................................. 23 2.5 Armadilhas de auto-inoculação de insetos praga por entomopatógenos ......... 24 3 MATERIAL E MÉTODOS ....................................................................................... 27 3.1 Seleção de isolados de Beauveria bassiana sensu lato para o controle de Hypothenemus hampei .......................................................................................... 27 3.1.1 Criação de Hypothenemus hampei ............................................................... 27 3.1.2 Procedência dos isolados de Beauveria bassiana e preparo das suspensões ............................................................................................................................... 28 3.1.3 Seleção de isolados de Beauveria bassiana para o controle de Hypothenemus hampei .......................................................................................... 29 8 3.2 Produção e viabilidade de Beauveria bassiana após impregnação em diferentes tecidos têxteis e seu potencial para o controle de Hypothenemus hampei ................................................................................................................... 30 3.2.1 Seleção de um tecido têxtil para utilização como substrato de produção do fungo Beauveria bassiana após impregnação nos tecidos .................................... 30 3.2.2 Mortalidade de Hypothenemus hampei após exposição por diferentes períodos a conídios de Beauveria bassiana produzidos após impregnação sobre tecido têxtil............................................................................................................. 32 3.2.3 Influência da luz na viabilidade e concentração de conídios de Beauveria bassiana produzidos após impregnação em tecido têxtil ...................................... 33 3.2.4 Viabilidade e concentração de conídios de Beauveria bassiana produzidos após impregnação sobre tecido têxtil ao longo do armazenamento em diferentes umidades relativas do ar ....................................................................................... 33 3.3 Eficiência de armadilha de auto-inoculação para o controle de Hypothenemus hampei com Beauveria bassiana em tecido sintético em condições de campo .... 34 3.3.1 Armadilha de auto-inoculação ...................................................................... 35 3.3.2 Delineamento experimental dos estudos de campo com armadilhas ........... 37 3.3.2.1 Captura de Hypothenemus hampei pelas armadilhas e avaliação da sua infecção por Beauveria bassiana na armadilha de auto-inoculação ...................... 39 3.3.2.2 Monitoramento da viabilidade e concentração de Beauveria bassiana produzido após impregnação sobre faixas de tecido na armadilha de auto- inoculação ............................................................................................................. 40 3.3.3 Dados climáticos .......................................................................................... 42 3.4 Análise estatística ............................................................................................ 42 4 RESULTADOS E DISCUSSÃO ............................................................................. 45 4.1 Resultados ....................................................................................................... 45 4.1.1 Seleção de isolados de Beauveria bassiana para controle de Hypothenemus hampei ................................................................................................................... 45 9 4.1.2 Produção e viabilidade de Beauveria bassiana após impregnação em diferentes tecidos têxteis e seu potencial para controle de Hypothenemus hampei ............................................................................................................................... 46 4.1.2.1 Seleção de um tecido têxtil para utilização como substrato de produção do fungo Beauveria bassiana após impregnação sobre os tecidos ............................ 46 4.1.2.2 Mortalidade de Hypothenemus hampei expostos por diferentes períodos a conídios de Beauveria bassiana produzidos após impregnação sobre tecido têxtil ............................................................................................................................... 48 4.1.2.3 Influência da luz na viabilidade e concentração de conídios de Beauveria bassiana produzidos após impregnação em tecido têxtil ....................................... 50 4.1.2.4 Viabilidade e concentração de conídios de Beauveria bassiana produzidos após impregnação sobre tecido têxtil ao longo do armazenamento em diferentes umidades relativas do ar ........................................................................................ 52 4.1.3 Eficiência de armadilha de auto-inoculação para o controle de Hypothenemus hampei com Beauveria bassiana em tecido sintético em condições de campo ............................................................................................................... 54 4.2 Discussão ........................................................................................................ 66 5 CONSIDERAÇÕES FINAIS ................................................................................... 75 REFERÊNCIAS ......................................................................................................... 77 10 11 RESUMO Desenvolvimento de armadilha de auto-inoculação par a o controle de Hypothenemus hampei (Ferrari, 1867) (Coleoptera: Curculionidae) com Beauveria bassiana (Bals.) Vuil (Ascomycota: Hypocreales) em tecido sintético O controle de Hypothenemus hampei é realizado basicamente com uso de inseticidas químicos, especialmente aqueles a base de endossulfan, cuja comercialização será proibida no Brasil a partir de julho de 2013. Diante disso, outras estratégias devem ser integradas buscando-se o controle desta praga com menor impacto ao ambiente. Nesse contexto, o fungo Beauveria bassiana destaca- se como um dos agentes de controle biológicos mais promissores. Neste estudo, buscou-se a associação da técnica de impregnação de tecido têxtil com B. bassiana associado à armadilha contendo a mistura de alcoóis metanol: etanol (1:1 v/v) como atraentes químicos para H. hampei, visando a auto-inoculação e disseminação do fungo pelo inseto, visando o seu controle. Inicialmente foi determinado em laboratório, a virulência de nove isolados de B. bassiana, através da pulverização de suspensões de 107 conídios.mL-1, diretamente sobre adultos de H. hampei. Todos os isolados apresentaram baixa virulência ao inseto, com mortalidade máxima de 38,5%. O isolado ESALQ-PL63 foi escolhido para dar continuidade aos estudos por possuir registro de comercialização. Posteriormente, sete tecidos têxteis sintéticos foram avaliados quanto à produção do isolado selecionado sobre sua superfície em duas condições de luz (fotofase de 0 e 12 horas). O tecido sintético Lã “Sherpa” foi selecionado por permitir uma maior produção de conídios nas duas condições testadas, atingindo até 5,44 × 108 conídios.cm-2. A exposição de H. hampei ao tecido com o fungo por apenas 5 segundos foi suficiente para causar 88,5% de mortalidade dos insetos. Em área de café sombreado foram conduzidos dois experimentos para avaliar uma armadilha de auto-inoculação contendo o patógeno produzido sobre o tecido. Foram usadas duas armadilhas controle, sendo uma armadilha de auto- inoculação sem fungo e uma armadilha de eficiência reconhecida (modelo IAPAR). A eficiência de coleta da armadilha de auto-inoculação com o fungo foi menor do que a armadilha IAPAR, mas esta se mostrou eficiente na contaminação e mortalidade dos insetos pelo fungo. No primeiro experimento, a mortalidade confirmada pelo patógeno no último dia de avaliação (151 dias) foi de 64,7%. A viabilidade dos conídios passou de 98,3%, logo após a montagem das armadilhas, para 86,9% após 65 dias. Após160 dias a viabilidade reduziu para 44,0%. No segundo experimento, a última avaliação foi realizada após 40 dias, sendo nesta data observada mortalidade confirmada de 89,9% e viabilidade dos conídios de 78,1%. Em ambos os experimentos a concentração de conídios reduziu-se ao longo do tempo. O sistema de auto-inoculação apresentou resultados promissores, mas sendo necessárias alterações na armadilha para aumentar a captura de insetos e estudos epizootiológicos para avaliar a capacidade de disseminação da doença no campo pelos insetos que passaram pela armadilha. Palavras-chave: Entomopatógenos; Disseminação; Epizootia; Semioquímico; Broca- do-café 12 13 ABSTRACT Development of self-inoculation trap for controllin g Hypothenemus hampei (Ferrari, 1867) (Coleoptera: Curculionidae) with Beauveria bassiana (Bals.) Vuil (Ascomycota: Hypocreales) in synthetic fabric The control of Hypothenemus hampei is accomplished primarily with the use of chemical insecticides, mainly endossulfan, whose commercialization will be prohibited in Brazil in July 2013. Therefore, other strategies must be integrated seeking control of this pest with less impact on the environment. In this context, the fungus Beauveria bassiana stands out as one of the most promising biological control agents. In this study, we associated the technique of fabric impregnated with B. bassiana with a trap containing a mixture methanol: ethanol (1:1 v/v) as an attractive chemical for H. hampei, aiming the self-inoculation and fungus dissemination by the insect, therefore their control. Initially, we determined in the laboratory, the virulence of nine isolates of B. bassiana using a spray suspension of 107 conidia.mL-1 directly on adults of H. hampei. All isolates showed low virulence to insects, with maximum mortality of 38.5%. The isolate ESALQ-PL63 was chosen to continue the studies for having a market register. Subsequently, seven synthetic fabrics were evaluated for the production of the selected isolate on its surface under two light conditions (photofase of 0 and 12 hours). The synthetic fabric Lã “Sherpa” was selected because it allows greater conidia production under the two conditions tested, reaching 5.44 × 108 conidia.cm-2. Exposure of H. hampei to the fabric impregnated with the fungus for only 5 seconds was enough to cause 88.5% of insect mortality. In an area of shaded coffee, two experiments were conducted to evaluate a self-inoculation trap containing the pathogen. We used two control traps without fungus: one self-inoculation trap without the fungus and a widely recognized efficient trap (IAPAR model). The collection efficiency of the self-inoculation trap with the fungus was lower than that of the IAPAR trap, however, it proved effective in contamination and insect mortality caused by the fungus. In the first experiment, mortality caused by the pathogen at the last evaluation day (151 days) was 64.7%. The viability of the conidia surpassed 98.3% after the assembly of the traps and 86.9%, after 65 days. After 160 days, the viability decreased to 44.0%. In the second experiment, the last evaluation was performed after 40 days, when we observed mortality of 89.9% and conidia viability of 78.1%. In both experiments, the conidia concentration reduced over time. The self-inoculation system showed promising results, but changes are needed to increase insect catches and further epizootiological studies to assess the possibility of disease spread in the field by insects that crossed the trap. Keywords: Entomopathogens; Dissemination; Epizootics; Semiochemical; Coffee berry borer 14 15 1 INTRODUÇÃO A broca-do-café, Hypothenemus hampei (Ferrari, 1867) (Coleoptera: Curculionidae: Scolytinae), é o principal inseto-praga da cafeicultura mundial, causando perdas quantitativas e qualitativas sobre a produção (VEGA et al., 2009). O controle de H. hampei é realizado de forma diferenciado dependendo do sistema de cultivo do cafeeiro. No Brasil o sistema convencional de produção de café é predominante. Entretanto, nos últimos anos a produção de café orgânico vem apresentando grandes crescimentos por meio da expansão do mercado interno e da conquista de novos nichos de mercado. Apesar da conjuntura econômica favorável, o segmento apresenta algumas dificuldades, especialmente no manejo fitossanitário da cultura, incluindo o controle de H. hampei. A inexistência de técnicas eficientes de manejo e compatíveis com os sistemas orgânicos tem sido uma séria limitação. Por outro lado, o controle dessa espécie-praga nos sistemas convencionais de cultivo é dependente quase que exclusivamente da aplicação de formulações de inseticidas sintéticos tendo como ingrediente ativo o endossulfan (MAPA/Agrofit, 2012). Contudo, devido a sua periculosidade comprovada, tanto para o homem quanto para o meio ambiente, estes inseticidas serão totalmente banidos do Brasil a partir de julho de 2013 (BRASIL, 2010). Neste sentido, alternativas de controle para a broca-do-café que apresentem menor impacto ao homem e ao meio ambiente e que sejam economicamente viáveis fazem-se necessárias no manejo dessa praga. Apesar de Beauveria bassiana (Bals.) Vuil (Ascomycota: Hypocreales) apresentar potencial para o controle da broca-do-café e frequentemente causar enzootias neste inseto, até o momento poucos são os estudos que demonstraram a eficácia deste fungo no controle de H. hampei em condições de campo. Para viabilizar essas pesquisas, é necessário que sejam desenvolvidos estudos básicos para a seleção de isolados de alta eficiência e técnicas adequadas de liberação deste patógeno. Como exemplo de método de liberação de fungos entomopatogênicos, tem-se a técnica de impregnação de tecido têxtil com esses patógenos, que pode contribuir para manter o inóculo em campo aumentando assim, sua eficácia. Essa técnica já foi testada no controle de Psacothea hilaris (Pascoe) (Coleoptera: Cerambycidae) (HIGUCHI et al., 1997) Anoplophora glabripennis (Motschulsky) (Coleoptera: 16 Cerambycidae) (DUBOIS et al., 2004a; HAJEK et al., 2006) e Capnodis tenebrionis (L.) (Coleoptera: Buprestidae) (MARANNINO et al., 2008) e apresentaram resultados promissores. Diferentemente desses coleópteros que caminham nos troncos das plantas hospedeiras após a emergência, H. hampei permanece no interior dos frutos durante boa parte do seu ciclo de vida e apenas as fêmeas recém-copuladas e que ainda não ovipositaram, denominadas colonizadoras, é que abandonam o fruto onde se desenvolveram para colonizarem frutos novos (MATHIEU et al., 2001), momento este em que estão expostas a ação dos entomopatógenos. Outra técnica empregada na captura e monitoramento da broca-do-café é a utilização de armadilhas atrativas contendo mistura de álcoois, tais como o etanol e metanol (UEMURA-LIMA et al., 2010). A associação desses dois métodos, ou seja, armadilha atrativa mais entomopatógenos, poderia ser útil no manejo integrado de H. hampei em cafezais. De acordo com Batista-Filho; Abrahão; Cruz (1988), a aplicação de conídios puros de B. bassiana na parede interna de uma armadilha utilizada para o monitoramento da broca-do-café, resultou em infecção de até 100% dos insetos capturados. No entanto, não mostraram informações quanto à persistência deste sistema no campo. Dessa forma, objetivou-se desenvolver um método para viabilizar a disseminação do fungo B. bassiana impregnado em tecido têxtil através de armadilhas contendo atraentes químicos para o controle de H. hampei. Para tanto, foram realizados estudos de seleção de isolados para utilização nas armadilhas, escolha de um tecido sintético que permitisse a maior produção do fungo, determinar o período de tempo necessário para que os insetos adquirissem a concentração letal de conídios sobre o tecido selecionado, determinar a longevidade dos conídios em tecido quando armazenados em diferentes condições de umidades relativas e luminosidades. Por fim, estudar em campo o uso de tecido contendo conídios do fungo em uma armadilha atrativa ao inseto para o seu controle. 17 2 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA 2.1 Importância de Hypothenemus hampei Nas regiões tropicais há aproximadamente 25 milhões de produtores de café sendo que a broca-do-café, Hypothenemus hampei (Ferrari, 1867) (Coleoptera: Curculionidae: Scolytinae), é a principal praga de cafeicultura mundial (JARAMILLO et al., 2011). H. hampei foi introduzida no Brasil, pela região de Campinas/SP, em 1913, a partir de sementes infestadas vindas da África, seu local de origem, estando hoje presente em todas as regiões cafeeiras do país (SOUZA; REIS, 1997). Ao se alimentar das sementes do café, a broca causa prejuízos quantitativos, como a queda prematura de frutos e perda de peso dos grãos, e qualitativos, como a perda do valor comercial do produto devido aos grãos brocados (DAMON, 2000). Além disso, o ataque aos frutos ocorre em qualquer estádio de maturação, desde verdes até maduros (cerejas) ou secos (SOUZA; REIS, 1997). Quando ocorrem 20% de grãos brocados a perda de peso no café beneficiado pode chegar a 6,8% e nos casos mais severos, com 80% de grãos brocados as perdas no peso dos grãos podem alcançar 24,4% (PIMENTA; VILELA, 1999). Adicionalmente, devido ao orifício de entrada da broca no fruto, ocorre à entrada de diversos microrganismos, dentre estes, fungos produtores de toxina que depreciam a qualidade da bebida e podem afetar a saúde humana. 2.2 Aspectos bioecológicos de Hypothenemus hampei 2.2.1 Descrição e ciclo de vida de Hypothenemus hampei Os ovos de H. hampei são elípticos ou levemente ovóides de coloração leitosa com diâmetro do eixo maior e menor de 0,599 e 0,314 mm, respectivamente (BERGAMIN, 1943). As larvas apresentam cápsula cefálica larga de coloração amarelo-palha com bordos levemente recurvados. As pupas inicialmente são brancas se tornando amareladas com a formação dos apêndices do inseto (FERNÁNDEZ; CORDERO, 2007). O adulto da broca é um besouro de coloração preta, corpo cilíndrico e ligeiramente recurvado para a região posterior. Os élitros são revestidos de cerdas e escamas piriformes, as fêmeas apresentam 1,75 mm de 18 comprimento e os machos assemelham morfologicamente com as fêmeas, sendo, entretanto, menores com 1,24 mm de comprimento e com asas rudimentares. A fêmea abre galerias nos frutos, local onde coloca seus ovos, podendo colocar de dois a três ovos por dia com oviposição regular de 15 a 20 dias após o início da postura, decrescendo posteriormente. O número de fêmeas é dez vezes maior que de machos (BERGAMIN, 1943). A broca-do-café é uma espécie críptica passando o seu ciclo de ovo a adulto dentro do fruto (MATHIEU et al., 2001). Seu ciclo biológico sofre influência direta das condições climáticas e do estádio fenológico do fruto. Fernández e Cordero (2007) estudando a biologia de H. hampei, observaram que a 27,1 oC e 65,3% UR obtêm-se uma duração de 4,2 dias para fase de ovo, 11,1 dias para larva, 2,6 dias pré-pupa, 5,3 dias para pupa. Bergamin (1943) observou que a 24,5 oC a duração total do ciclo deste inseto ocorre em 27,5 dias. Nestas condições a longevidade média das fêmeas pode chegar a 156 dias e dos machos, de 78 a 103 dias. Jaramillo et al. (2009) estudaram alguns parâmetros biológicos de H. hampei em diferentes temperaturas (15 a 33 oC), determinaram os limites térmicos de desenvolvimento deste inseto, sendo 14,9 oC o limite inferior e 32 oC o limite superior. Para a temperatura de 25 oC o ciclo de ovo-adulto foi de 27 dias onde observaram a maior taxa reprodutiva. 2.2.2 Aspectos comportamentais de Hypothenemus hampei O comportamento deste inseto é bastante peculiar. Fêmeas virgens após a cópula abandonam os frutos nativos para procurarem novos hospedeiros, essas são denominadas fêmeas colonizadoras enquanto os machos permanecem dentro do fruto onde nasceram (MATHIEU et al., 2001). Silva et al., (2012) observaram em laboratório que fêmeas e machos virgens da broca-do-café, acasalam poucas horas após a emergência, possuindo um comportamento de pré-cópula, cópula e pós- cópula, semelhantes a outros Scolytinae. Dentre os principais fatores que mais influenciam o abandono do fruto pela broca é possível citar: o estádio fenológico do fruto, aumento da luminosidade, voláteis emitidos pelos frutos, período chuvoso e o estado fisiológico das fêmeas (MATHIEU; BRUN; FRÉROT, 1997, FERREIRA et al., 2000). 19 A localização dos frutos de café pela broca, que é fator chave para o início do processo de alimentação, também pode ser mediado pela emissão de voláteis dos frutos, sendo que a resposta é mais evidente em frutos maduros quando comparados aos verdes e secos (GEORDANENGO; BRUN; FRÉROT, 1993). Mathieu; Malosse e Frérot (1998) identificaram 45 substâncias químicas liberadas pelos frutos, dividias em cinco grupos químicos: os alcoóis, cetonas/aldeídos, acetatos, terpenos, e sesquiterpenos. Mais recentemente seis compostos voláteis eletrofisiologicamente ativos de Coffea arabica L foram identificados sendo que quatro destas substâncias mostraram respostas significativas a H. hampei (MENDESIL et al., 2009). A infestação de uma nova safra de café é iniciada por insetos oriundos dos frutos remanescentes da safra anterior e considerando a biologia da praga é possível afirmar que as medidas de controle devem acontecer entre o final de uma safra e o início da maturação de frutos da safra seguinte. Dessa forma o controle de adultos deve ser concentrado previamente ao início das posturas (CURE et al., 1998). Teixeira; Souza e Costa (2006) observaram que durante o período de frutificação do café a queda de frutos ocorre continuamente, sendo que a porcentagem de frutos brocados no solo chega a ser de 4 a 20 vezes maior que os frutos na planta. 2.3 Controle de Hypothenemus hampei 2.3.1 Controle químico A broca-do-café é notoriamente de difícil controle, por passar quase todo o ciclo de vida dentro da semente do café. O período que o inseto é mais vulnerável ao controle químico é no final da entressafra, quando as fêmeas colonizadoras saem para encontrar novos frutos (DAMON, 2000). Como isso, o sucesso no controle de H. hampei depende de uma amostragem correta para determinação dos níveis de infestação. Recomenda-se que a aplicação de inseticidas químicos seja realizada quando a porcentagem de infestação chegar a 5%. Os principais produtos químicos para o controle da broca são à base do ingrediente ativo endossulfan (MAPA/Agrofit, 2012). Novas alternativas de controle devem ser buscadas, pois esta molécula possui elevada toxidade ao homem e ao meio ambiente e, por esta razão sua 20 comercialização será proibida no Brasil a parti de julho de 2013 (BRASIL, 2010). Além disso, já foram registrados casos de resistência de H. hampei a essa molécula (BRUN et al. 1989; BRUN et al., 1990). 2.3.2 Controle por comportamento: uso de armadilhas com atraentes químicos para monitoramento e controle de Hypothenemus hampei Mendonza-Moura (1991) foi um dos pioneiros a demonstrar a atração de H. hampei por armadilhas contendo metanol: etanol. Posteriormente a constatação de que a atração de H. hampei por frutos de café é mediada por voláteis produzidos por estas estruturas, e a identificação dos compostos envolvidos nessa atração (GEORDANENGO; BRUN; FRÉROT, 1993; MATHIEU; MALOSSE; FRÉROT, 1998) despertou ainda mais o interesse para o desenvolvimento de armadilhas iscadas com atraentes químicos para o monitoramente e controle desse inseto, sendo a mistura dos alcoóis metanol e etanol a mais utilizada como atrativo em armadilhas para captura da broca-do-café. Mathieu et al. (1997), estudando o efeito da cor e da taxa de liberação do atraente etanol: metanol (1:1) na captura de fêmeas da H. hampei em armadilhas de múltiplos funis, observaram que a cor vermelha exerceu a maior atração visual combinada com a menor taxa de liberação do atraente químico (0,5 g/dia/difusor). Silva, Ventura e Morales (2006) trabalharam com armadilhas adaptadas do modelo IAPAR, constituídas de garrafas plásticas de 2 L contendo uma abertura de 13 × 18 cm, constataram que a proporção metanol: etanol (1:1) colocadas a 1,20 m do nível do solo, foi eficiente para a captura da brocas. Uemura- Lima et al. (2010) trabalhando com o modelo IAPAR e suas modificações na captura de H. hampei nos períodos vegetativos e reprodutivos de plantas de café, tiveram para o modelo IAPAR capturas de 22,8 e 118,6 brocas/armadilha, respectivamente. Dufour e Frérot (2008) mostraram que armadilhas iscadas com etanol: metanol, colocadas a 1,20 m do nível do solo aliadas a coloração vermelha aumentou substancialmente a atração da broca-do-café. Esses autores sugerem uma densidade de 22 armadilhas/ha espaçadas a 15 m para monitoramento e controle desde inseto. Apesar de vários estudos com armadilha contendo atraentes químicos para monitoramento e controle de H. hampei, os resultados são conflitantes não havendo uma recomendação adequada de uso. 21 2.3.3 Controle biológico A utilização de inimigos naturais como parasitóides, predadores e patógenos é uma alternativa promissora para o controle da broca-do-café do ponto de vista social, econômico e ambiental. Os parasitóides Cephalonomia stephanoderis Betrem (Hymenoptera: Bethylidae), Prorops nasuta Waterston (Hymenoptera: Bethylidae) e Phymastichus coffea La Salle (Hymenoptera: Eulophidae) são as espécies que se encontram comumente associadas a H. hampei (DAMON, 2000). Em 1929, o parasitóide P. nasuta, vulgarmente denominado vespa-de-Uganda foi introduzido no Brasil para controle da broca, porém sem sucesso (SOUZA; REIS, 1997). Dentre os inimigos naturais para controle de H. hampei, os fungos têm se destacado por possuírem um número variado de espécies que infectam H. hampei, tais como Beauveria bassiana (Bals.) Vuil, Metarhizium anisopliae (Metsch.) Sorokin, Isaria farinosa (Holmsk), I. fumosorosea Wize, Lecanicillium lecanii (Zimm), Nomuraea rileyi (Farl) Samson e Ophiocordyceps entomorrhiza (Dicks) (BUSTILLO et al., 1999; VEGA et al., 1999). Entretanto, De La Rosa et al., (2000) constataramem condições de campo que B. bassiana é mais eficiente no controle de H. hampei do que M. anisopliae. O fungo B. bassiana também tem sido a espécie mais relatada em todo mundo (VEGA et al., 2009). No Brasil, B. bassiana foi relatada ocorrendo naturalmente sobre H. hampei no litoral e norte do Paraná (VILLACORTA, 1984), no Espírito Santo (BENASSI, 1995), em Minas Gerais (SOUSA; REIS, 1997), e em Rondônia (COSTA et al., 2002). Quando B. bassiana infecta H. hampei, os insetos morrem geralmente próximo à coroa do fruto, com o corpo coberto por esporos esbranquiçados o que contribui para disseminação deste agente promovendo outros focos da doença no campo (NEVES; HIROSE, 2005). Com o propósito de avaliar a ação dos fungos como agentes entomopatogênicos no controle de H. hampei, diversos trabalhos foram desenvolvidos em condições de campo e laboratório, utilizando para isso, inúmeras metodologias. Jiménez-Gómez (1992) desinfestou superficialmente a cutícula das brocas com água destilada mais 0,025% de Triton X-100, posteriormente, através da imersão das brocas por 10s nas suspensões 107 conídios.mL-1 observaram após 8 dias mortalidade entre 7,1 e 94,4%. González; Posada e Bustillo (1993) avaliaram dois isolados de B. bassiana para controle da broca-do-café. Eles desinfestaram a 22 superfície da cutícula do inseto com 0,5% de hipoclorito de sódio, imergiram as brocas por 2 min em 107 conídios.mL-1, obtendo uma mortalidade 88,9 e 100% após 10 dias de incubação dos insetos. Dez dias após a pulverização das brocas com 107 conídios.mL-1 de isolados de B. bassiana, observou-se uma redução de 75% na sobrevivência com um TL50 de 6,25 dias quando pulverizados com o isolado 8906. Para outros cinco isolados também avaliados a mortalidade variou de 24,1 a 35% (VARELA; MORALES, 1996). Quando H. hampei foi inoculado por imersão em concentração de 106 conídios.mL-1 de isolados de B. bassiana e alimentados com café pergaminho durante oito dias de incubação a mortalidade foi de 18,8 a 93% (HARAPRASAD et al., 2001). Quando a mesma concentração foi aplicada em plantas de café em campo após 24 dias observaram uma mortalidade superior a 70%. De La Rosa et al. (2000) fizeram pulverizações de B. bassiana e M. anisopliae para controle da broca- do-café em cafezais de diferentes altitudes na dose de 109 conídios por planta. As porcentagens de mortalidade variaram de 14,3 a 40,6% para B. bassiana e 6,3 a 22,1% para M. anisopliae. A pulverização de B. bassiana em grãos de café em terreiro de secagem na concentração 1011 conídios/mL resultou em 50% de infecção da população emergente (OKUMURA et al., 2003). Neves e Hirose (2005) selecionaram isolados de B. bassiana para controle da H. hampei, aplicando 0,1 mL da suspensão fúngica de 107 conídios.mL-1 diretamente com pulverizador “Pasche” sobre os insetos mantidos em tubos de vidro, e obtiveram uma mortalidade corrigida de 23,6 a 68% em cinco dias após a inoculação. Mortalidades de 100% dos insetos foram obtidas para 47 isolados inoculados por imersão por 2 min em suspensões de 107 conídios.mL-1 (0,1% de Tritonx X-100) de B. bassiana, após 17 dias (POSADA; VEGA, 2005). Quando mistura de isolados de B. bassiana com baixa virulência individual a H. hampei foram aplicados resultou em mortalidade elevada chegando a 93% (CRUZ; GAITAM; GONGORA, 2006). Pulverizações com suspensão de 109 conídios de B. bassiana por cafeeiro diretamente sobre frutos de café infestados artificialmente com H. hampei colocadas sobre o solo na base das plantas resultaram em redução de até 74% dos insetos presentes no interior das bagas, após 30 dias da aplicação (VERA et al., 2011). A aplicação de 107 conídios.mL-1 de isolados de B. bassiana em disco de papel de filtro, resultou em mortalidade de 53 a 95,7% da broca-do-café (SAMUELS; PEREIRA; GAVA, 2010). 23 A aplicação do fungo em campo pode ser realizada pulverizando toda a planta, durante o período de “trânsito da broca”, e quando a infestação atingir entre 1% e 2% de frutos atacados. As concentrações a serem usadas variam entre 1,0 × 1012 a 2,0 × 1012 conídios/hectare devendo ser aplicados em 200 a 400 litros de calda, sempre em constante agitação (NEVES; SANTORO; SILVA, 2006). 2.4 Utilização de tecidos sintéticos impregnados com entomopatógenos no controle de pragas Baseados no conhecimento do comportamento de alguns cerambicídeos que apresentam o hábito de andarem no tronco de árvores após emergirem foram desenvolvidos estratégias de uso de tecidos têxteis impregnados com fungos entomopatogênicos e colocadas em torno dos troncos de árvores para infecção desses coleópteros e disseminação do patógeno no ambiente. Stand et al., (1991) inocularam o fungo Beauveria brongniartii (Sacc.) Petch em tecido, resultando em sua esporulação na superfície deste material. Este tecido foi colocado em volta de troncos de árvores o que resultou em até 100% de mortalidade de Semanotus japonicus (Coleoptera: Cerambycidae). Shimazu et al., (1995) utilizaram tecido impregnados com B. bassiana colocados também em troncos de árvores para controle de larvas de Monochamus alternatus Hope (Coleoptera: Cerambycidae), alcançando 100% de mortalidade das larvas. Posteriormente, novos estudos foram conduzidos com o fungo B. brongniartii impregnado em fibra de tecido onde foi possível a constatação de 70% de infecção do coleóptero Psacothea hilaris (Coleoptera: Cerambycidae) em condições de campo (HIGUCHI et al., 1997). Os mesmos autores constataram ainda que, quando tecidos impregnado com o fungo foram armazenadas por 400 dias a 5ºC em sacos de polietileno e também por 30 dias a 37ºC, o fungo não mostrou perda significativa da sua infectividade, o que resultou no produto comercial Biolisa Kamikiri®. O uso de fibra de tecido inoculado com os fungos B. brongniartii, (Biolisa Kamikiri®), B. bassiana e M. anisopliae foi estudado no campo e em laboratório por vários autores no controle de Anoplophora glabripennis Motschulsky (Coleoptera: Cerambycidae), obtendo resultados satisfatórios (DUBOIS et. al., 2004a; 2004b; HAJEK et. al., 2006; SHANLEY; HAJEK, 2008; SHANLEY et. al., 2009). Shanley et. al (2009) observaram que tecido impregnado com M. anisopliae expostas a 24 condições de campo, permaneceram virulentas a adultos de A. glabripennis por 112 dias. Shanley e Hajek (2008) observaram que a dispersão de conídios de M. anisopliae presentes em tecidos, após serem colocadas em troncos de árvores possui potencial para controle de A. glabripennis. A utilização de tecido têxtil de poliéster impregnados com B. bassiana resultou em 32% de mortalidade de Agrilus planipennis (Coleoptera: Buprestidae) (LIU; BAUER, 2008). Marannino et. al. (2008) estudando em laboratório o efeito de fibra de tecidos impregnado com conídios de M. anisopliae para o controle de Capnodis tenebrionis (Coleoptera: Buprestidae) observaram mortalidade de até 100% dos insetos. Tecido impregnado com M. anisopliae em troncos de Carya illinoinensis (Wangenh.) resultou em aproximadamente 50% de mortalidade de Curculio caryae (Coleoptera: Curculionidae) (SHAPIRO-ILAN et al., 2009a) e posteriormente usando metodologia similar com fibra de tecido contento de M. anisopliae, encontrou mortalidade superior a 80% de C. caryae (SHAPIRO-ILAN et al., 2009b). Esses resultados mostram que esta técnica é eficiente, permanecendo infectivo a estes insetos alvo por vários dias em condições de campo e merecem ser estudadas para o controle de outras pragas. 2.5 Armadilhas de auto-inoculação de insetos praga por entomopatógenos O uso de armadilhas iscadas com atraentes químicos em associação com agentes entomopatogênicos para o controle de insetos praga já foi estudada por diversos autores (VEGA; DOWD; BARTELT, 1995). Maniania (1998) testou dispositivos para atrair as moscas tsé-tsé Glossina pallidipes, G. longipennis, G. fuscipes fuscipes (Diptera: Muscidae) e após contato com os conídios de M. anisopliae colocados sobre malha de náilon em uma armadilha atrativa alcançaram 80% de infecção e com eficiência de mais de 21 dias no campo. Armadilha para auto-inoculação de Liriomyza huidobrensis (Diptera: Agromyzidae) por M. anisopliae, por meio de conídios puros espalhados sobre um tecido aveludado colocado na região central de uma armadilha tubular, resultaram em mortalidade de 100% para os insetos atraídos pela cor amarela que passaram pelo dispositivo em condições de laboratório, (MIGIRO et al., 2010). Niassy et al. (2011) testaram um dispositivo de auto-inoculação de Frankliniella occidentalis (Pergande) (Thysanoptera: Thripidae) com M. anisopliae espalhado sobre um pano 25 de veludo colocado dentro da armadilha. Estes autores obtiveram resultados promissores alcançando mortalidade superior a 77%. Conídios puros de B. bassiana foram colocados na parede interna de armadilha utilizada para monitoramento de H. hampei, alcançando 100% de infecção de H. hampei capturadas (BATISTA-FILHO; ABRAHÃO; CRUZ, 1988). No entanto não se tem relato da duração deste tipo de controle no campo, levando em consideração o tempo em que o patógeno fica infectivo a esse inseto e merecendo estudos mais aprofundados para tentar uma forma de viabilizar esse tipo de controle para broca-do-café. 26 27 3 MATERIAL E MÉTODOS Os experimentos foram conduzidos no Laboratório de Patologia e Controle Microbiano de Insetos do Departamento de Entomologia e Acarologia e na Fazenda Areão da Escola Superior de Agricultura “Luiz de Queiroz”, Universidade de São Paulo (ESALQ-USP), Piracicaba, São Paulo, Brasil. 3.1 Seleção de isolados de Beauveria bassiana sensu lato para o controle de Hypothenemus hampei 3.1.1 Criação de Hypothenemus hampei Os insetos foram obtidos da criação estoque do Laboratório de Ecologia Química e Comportamento de Insetos da ESALQ/USP. A população inicial desta criação foi oriunda de área de café (Coffea arabica L. var. Catuaí Vermelho) produzido organicamente, localizado na cidade de Dois Córregos, São Paulo. No laboratório (23 ± 2 oC, 60 ± 10% UR e fotofase de 12 horas) as brocas foram mantidas em recipientes plásticos (17,5 × 12,5 × 6,5 cm) forrados com papel toalha e sobre estes, disposta uma camada dupla de café pergaminho hidratado em água por volta de cinco dias para que a umidade ficasse em torno de 45%. As tampas dos recipientes foram furadas e vedadas com tecido “voile” preto para circulação de ar. Esse procedimento foi realizado com fêmeas colonizadoras que saiam naturalmente dos pergaminhos infestados em busca de outros frutos, para induzir novas infestações e continuidade da criação (SILVA, et al., 2012). Nos bioensaios foram utilizadas fêmeas “colonizadoras” de H. hampei com 1 a 10 dias de idade apresentando cutícula totalmente melanizada. As coletas das brocas, para realização dos bioensaios, foram realizadas após a saída natural desses insetos do pergaminho, a qual ocorre no período vespertino. Ao observar as revoadas no interior dos recipientes de criação, estes foram transferidos para gaiolas maiores e as brocas que encontradas nas paredes da gaiola foram coletadas com auxílio de tubos de vidro. 28 3.1.2 Procedência dos isolados de Beauveria bassiana e preparo das suspensões Isolados de B. bassiana (Tabela 1) foram multiplicados em placas de Petri (90 × 15 mm) contendo Meio de cultura de Esporulação (ME: 0,36 g de KH2PO4; 1,05 g de Na2HPO4 7H20; 0,60 g de MgSO4 7H20; 1,00 g de KCL; 10,0 g de glucose; 1,58 g de NaNO3; 5,00 g de extrato de levedura; 20,0g de Agar e; 1000 mL de água destilada) estéril. Este procedimento foi realizado em câmara de fluxo laminar, a partir da transferência de pequena quantidade de inóculo que foi posteriormente espalhado por toda a área da placa, utilizando uma alça de Drigalski. As placas contendo os diferentes isolados do fungo foram mantidas em câmara climatizada tipo B.O.D (Biological Oxigen Demand) por um período de 10 dias, a 26 ± 1 oC e 12 horas de fotofase para esporulação. Os isolados encontram-se armazenados em freezer (-40 0C) na forma de conídios puros e pertencem ao banco de Patógenos do Laboratório de Patologia e Controle Microbiano de Insetos da ESALQ/USP. Tabela 1 - Procedência dos isolados de Beauveria bassiana sensu lato utilizados para avaliação da virulência a fêmeas “colonizadoras” de Hypothenemus hampei Isolados Origem Procedência ESALQ-PL63 Atta sp. Piracicaba, SP ESALQ-252 Hypothenemus hampei Piracicaba, SP ESALQ-1456 Solo de cafezal Guaxupé, MG ESALQ-1457 Solo de cafezal Guaxupé, MG ESALQ-1081 Solo de cafezal Piracicaba, SP ESALQ-1436 H. hampei Piracicaba, SP ESALQ-1451 H. hampei Piracicaba, SP ESALQ-1455 H. hampei Campinas, SP CB-66 H. hampei São José do Rio Pardo, SP Para o preparo das suspensões fúngicas que foram aplicadas sobre as brocas, os conídios desenvolvidos sobre o meio de cultura foram desagregados das placas através da adição de 20 mL de água destilada mais espalhante adesivo Tween 20® (0,05%) e raspagem com espátula estéril. Esta suspensão foi filtrada em tubo de fundo chato (85 × 25 mm) com uma gaze e após a filtragem a mesma foi 29 homogeneizada em aparelho Vortex®. Após diluições seriadas sua concentração foi determinada através da contagem em câmara de Neubauer e posteriormente as suspensões foram padronizadas para 107 conídios viáveis.mL-1 para aplicação sobre as brocas. Visando determinar a concentração de conídios viáveis.mL-1 utilizou-se a metodologia proposta por Oliveira (2009), sendo feita duas placas para cada isolado. 3.1.3 Seleção de isolados de Beauveria bassiana para o controle de Hypothenemus hampei Para os bioensaios de seleção foi adotado o delineamento experimental inteiramente aleatorizado, composto por nove isolados de B. bassiana (Tabela 1) e o tratamento controle, totalizando 10 tratamentos com quatro repetições de 13 brocas cada (n=52). Este experimento foi repetido duas vezes no tempo. Grupos de 13 brocas foram coletados da criação (item 3.1.1) com auxílio de tubos de vidro e transferidos para placas de Petri (40 mm de diâmetro). Estas placas foram colocadas no centro de placas de Petri maiores (140 mm de diâmetro) e em seguida procedeu-se a pulverização das brocas com alíquotas de 1 mL da suspensão fúngica (item 3.1.2) utilizando Torre de Potter com pressão de 15 libras.pol-1. No tratamento controle, os insetos receberam igual quantidade de água destilada mais espalhante adesivo Tween 20® (0,05%) estéril. Após a pulverização, com auxílio de pincel (no zero) de cerdas macias os insetos foram individualizados em placas de poliestireno, sendo uma placa de 24 poços para cada repetição, em seguida os insetos foram alimentados com pedaços de aproximadamente 1 mm3 de café pergaminho, hidratados por cinco dias através da imersão em água destilada. As placas contendo as brocas foram acondicionadas em câmara climatizada tipo B.O.D com 26 ± 1 oC, 70 ± 10% UR e 24 h de escotofase. As avaliações foram realizadas diariamente, durante um período de 10 dias contabilizando o número de brocas mortas. Detectada a mortalidade, a superfície externa dos insetos foi desinfestada por meio da imersão em álcool 70% por aproximadamente um minuto e lavagem com água destilada estéril. As brocas desinfestadas foram acondicionadas em câmara úmida e incubadas nas mesmas condições citadas anteriormente, por um período de 10 dias, para confirmação da mortalidade através da esporulação do patógeno. 30 3.2 Produção e viabilidade de Beauveria bassiana após impregnação em diferentes tecidos têxteis e seu potencial para o c ontrole de Hypothenemus hampei O isolado ESALQ-PL63 selecionado no experimento anterior (item 3.1) foi utilizado para comparar a produção de conídios viáveis sobre diferentes tecidos têxteis bem como para verificar a eficiência do tecido selecionado e impregnado com o fungo no controle de H. hampei, em condições de laboratório. Posteriormente, foi desenvolvido um estudo utilizando o tecido selecionado e impregnado com o fungo associado a uma armadilha de auto-inoculação para o controle de H. hampei no campo. 3.2.1 Seleção de um tecido têxtil para utilização co mo substrato de produção do fungo Beauveria bassiana após impregnação nos tecidos O isolado ESALQ-PL63 foi produzido em meio ME conforme descrito no item 3.1.2. Dois discos de 0,5 cm de diâmetro foram retirados com auxílio de um vazador estéril e inoculados em frascos de Erlenmeyer contendo 100 mL de meio liquido Sabouroud Dextrose e Extrato de Levedura (SDY: 40 g de dextrose, 10 g de peptona, 10 g de extrato de levedura para 1000 mL de água destilada). Os frascos foram mantidos sob agitação contínua em “shaker”, a 170 rpm, 26 ± 1 oC e com fotofase de 12 horas por um período de cinco dias. Tecidos têxteis de 30 × 30 mm (referidos também como tecidos não tecido ou tecidos sintéticos e artificiais descritos na Tabela 2) foram fixados em quadrados plásticos utilizando cola do tipo adesiva de contato tradicional Cascola® e após 24 horas de secagem foram esterilizados em autoclave a 120 oC durante 20 minutos. Para impregnação do tecido com o meio contendo o patógeno, 150 mL do meio liquido contendo células fúngicas conforme descrito anteriormente, foram misturados a 500 mL de meio Sabouroud Dextrose Ágar e Extrato de Levedura (SDAY: 40 g de dextrose, 10 g de peptona, 10 g de extrato levedura, 20 g de ágar para 1000 mL de água destilada) com uma temperatura de aproximadamente 45 oC. Tanto no meio liquido usado para crescimento do patógeno, quanto no meio solido morno, foram acrescentados 0,5 g.L-1 de antibiótico (Pentabiótico Veterinário Reforçado, Fort Dodge® Saúde Animal Ltda). Em câmera de fluxo laminar, os tecidos foram 31 submersos nesta mistura em um Becker com capacidade para 2 L (um por repetição), e retirados em seguida com o auxílio de uma pinça sendo o excesso de meio escorrido. Posteriormente os tecidos foram dispostos em bandejas plásticas estéreis, forradas com papel alumínio e vedadas com filme plástico de PVC (Magipack®) com pequenos furos para permitir a troca de ar com o ambiente. As bandejas foram mantidas em câmara climatizada do tipo B.O.D a 25 ± 1 oC, 60 ± 10% UR por um período de 10 dias para esporulação do patógeno (adaptado de SHANLEY et al., 2009). Tabela 2 - Especificações dos tecidos têxteis utilizados para avaliação do melhor substrato para impregnação do fungo Beauveria bassiana Tecidos Têxteis * Gramatura (g.m -2) Composição Lã “Sherpa” 180 100% Poliéster Sofit - 100% Poliéster Jade 100 100 50% Poliéster e 50% Viscose Jade 200 200 50% Poliéster e 50% Viscose Poly R1 100 100% Poliéster Poly R2 100 100% Poliéster Poly Esmeralda 300 100% Poliéster * Tecidos referidos também como tecidos não tecido (Nonwoven) ou tecidos sintéticos e artificiais - Informação não encontrada O delineamento experimental foi inteiramente aleatorizado em esquema fatorial 7 × 2, sendo, sete tecidos sintéticos (Tabela 2) e duas condições de luminosidade (0 e 12 horas de fotofase) com quatro repetições de um quadrado de tecido cada, e o experimento foi repetido duas vezes no tempo. O parâmetro avaliado para seleção do melhor tecido foi o número de conídios viáveis.cm-2. Para isso, os conídios produzidos na superfície dos tecidos foram desagregados dos mesmos para quantificação seguindo metodologia adaptada de Higuchi et al. (1997). Os tecidos foram colocados em frascos de vidro de 250 mL (marca Schott), contendo 50 mL de solução com dois espalhantes; 0,01% Tween 80® e 0,075% Solubiol. Os frascos foram mantidos sob agitação continua em “shaker”, a 300 rpm, em 26 ± 1oC por 40 minutos, colocados por 1 minuto em aparelho Ultrason e em seguida, agitados manualmente. Aproximadamente 10 mL da suspensão foi filtrada em tubo de ensaio (85 × 25 mm) com uma gaze. Após a 32 filtragem, a suspensão de conídios foi homogeneizada em aparelho Vortex® e sua concentração foi determinada através da contagem em câmara de Neubauer. Para avaliação da viabilidade dos conídios utilizou-se o método proposto por Oliveira (2009), permitindo a determinação do número conídios viáveis.cm-2 presente nos tecidos. 3.2.2 Mortalidade de Hypothenemus hampei após exposição por diferentes períodos a conídios de Beauveria bassiana produzidos após impregnação sobre tecido têxtil Na armadilha de auto-inoculação proposta no item 3.3.1 para controle da broca-do-café por meio da sua contaminação pelo fungo B. bassiana ao sair por um orifício onde o fungo é colocado impregnado em um tecido têxtil. Sendo assim, o tempo de contato do inseto com esses conídios deve ser suficiente para aquisição de uma concentração letal. Em observações preliminares quanto ao tempo em que as brocas colocadas dentro da armadilha de auto-inoculação levariam para sair, observou-se que algumas brocas conseguiam atravessar o orifício de saída com menos de 10 segundos o que poderia não ser suficiente para que este inseto adquirisse uma quantidade suficiente de conídios para provocar a sua mortalidade. Assim, a realização deste estudo visa determinar qual o menor tempo de exposição aos conídios presentes no tecido para infecção da broca pelo patógeno. Esse conhecimento é necessário para determinar as dimensões do orifício de saída e do tecido impregnado com o fungo na armadilha. Fêmeas “colonizadoras” de H. hampei foram submetidas ao contato com conídios de B. bassiana (isolado ESALQ-PL63) por diferentes tempos de exposição. Para isso, pedaços do tecido sintético Lã “Sherpa” (30 × 30 mm) foram impregnados com meio de cultura contendo o patógeno, e a concentração de conídios viáveis.cm- 2 determinada conforme item 3.2.1 (n=4). Foram montados dois experimentos em delineamento inteiramente aleatorizado com três tempos de exposição (5, 25 e 50 s) e com quatro repetições contendo 13 insetos cada (n=52). As brocas foram coletadas com tubos de vidro (item 3.1.1) e cuidadosamente colocadas sobre o tecido contendo o fungo esporulado e acondicionados em placa de Petri (90 × 15 mm). Após os respectivos tempos de exposição, os tecidos foram virados sobre um 33 papel filtro com auxílio de uma pinça para auxiliar na coleta das brocas utilizando para isso, um pincel de cerda macia número 0. Os insetos foram acondicionados em placa de Petri (90 × 15 mm) e alimentados com pedaços de 1 mm3 de pergaminho de café hidratado. As placas foram tampadas com tela branca de malha fina, incubadas e a mortalidade avaliada conforme item 3.1.1. No segundo experimento quantificou-se o número de conídios aderidos ao corpo das brocas após a exposição aos tecidos contendo o patógeno nos respectivos tempos. Neste experimento realizou-se quatro repetições com 10 insetos cada (n=40) que foram expostos aos conídios do patógeno conforme descrito anteriormente. Após a exposição grupos de 10 brocas (repetição) foram colocados em tubos Eppendorf sendo em seguida adicionado 1 mL de Tween 80® (0,01%), homogeneizado em aparelho Vortex® e o número de conídios foi determinado em câmera de Neubauer. 3.2.3 Influência da luz na viabilidade e concentraçã o de conídios de Beauveria bassiana produzidos após impregnação em tecido têxtil Os pedaços de Lã “Sherpa” (30 × 30 mm) foram impregnados com meio de cultura contendo o patógeno e avaliados conforme item 3.2.1. Os tratamentos foram mantidos em câmara climatizada do tipo B.O.D a 25 ± 1 oC, 60 ± 10% UR com 0 ou 12 horas de fotofase. Foi adotado o delineamento inteiramente aleatorizado em esquema fatorial 2 x 4, ou seja, duas condições de luminosidade, 12 horas de fotofase (com duas lâmpadas fluorescentes com aproximadamente 850 lux cada) e escuridão total com 4 tempos de avaliações (10, 15, 30, e 45 dias após inoculação), e quatro repetições (um pedaço de tecido) sendo este experimento repetidos três vezes no tempo. 3.2.4 Viabilidade e concentração de conídios de Beauveria bassiana produzidos após impregnação sobre tecido têxtil ao l ongo do armazenamento em diferentes umidades relativas do ar O delineamento experimental foi o inteiramente aleatorizado em esquema fatorial 3 × 4, sendo, três condições de umidades relativas do ar (40, 60 e 80%) e 4 tempos 34 de avaliações (5, 15, 30, 45 após armazenamento), com cinco repetições de três pedaços do tecido para cada tempo de avaliação (n=15). As umidades relativas foram conseguidas utilizando solução de hidróxido de potássio (500 mL por câmara de umidade) (SOLOMON, 1952). Para manutenção das referidas umidades relativas foram utilizadas câmaras de umidades constituídas de pote plástico circular com capacidade para 3,2 L (22,9 × 21,3 × 12,0 cm - Samremo®, linha Flor), com um anel de borracha na tampa que proporcionou a vedação hermética (CASTRO, 2011). Na parte interna das câmaras de umidade foi colocado um suporte plástico com parte superior e central contendo uma tela plástica que serviu como apoio das unidades experimentais (pedaços de tecido com patógeno) que por sua vez localizava-se em uma placa de Petri de plástico de 14 cm de diâmetro. As respectivas umidades internas foram confirmadas antes da montagem do experimento através de um termohigrômetro digital colocado no interior de uma câmara sobre o suporte interno em cada um dos tratamentos. Os pedaços (30 × 30 mm) do tecido sintético Lã “Sherpa” foram impregnados com meio contendo o isolado ESALQ-PL63 sendo o número de conídios e sua viabilidade quantificada conforme item 3.2.1. Após a inoculação todos os quadrados do tecido foram colocados em bandejas e incubados em B.O.D. a 25 ± 1 oC, UR 60 ± 10% e fotofase de 12 horas. Após 10 dias de incubação, a viabilidade e a concentração de conídios de 5 pedaços do tecido foram quantificados e este resultado extrapolado para todas as unidades experimentais (pedaços do tecido) usadas no início do experimento. Assim, todos os quadrados do tecido foram mantidos nas câmaras dos seus respectivos tratamentos após atingirem a esporulação máxima (10 dias após inoculação), considerando que a concentração inicial foi de 4,4 ± 0,07 × 108 conídios.cm-2 e a viabilidade de 98,7 ± 0,4%. As avaliações de concentração e viabilidade dos conídios no tecido de todos os tratamentos foram feitas aos 5, 15, 30 e 45 dias após o armazenamento em B.O.D a 25 ± 1 oC e fotofase de 12 horas. 3.3 Eficiência de armadilha de auto-inoculação para o controle de Hypothenemus hampei com Beauveria bassiana em tecido sintético em condições de campo Uma armadilha de auto-inoculação para controle de H. hampei foi desenvolvida contendo no seu interior um recipiente para liberação gradual do 35 atraente químico etanol: metanol na proporção de 1:1 e conídios do fungo B. bassiana produzido após impregnação sobre tecido têxtil selecionado no item 3.2.1. Esta armadilha foi utilizada no campo em diferentes estudos a fim de testar a sua eficiência de captura bem como a persistência do fungo em campo utilizando a armadilha IAPAR, reconhecidamente eficiente para captura deste inseto, como modelo de comparação (controle positivo) e o modelo de armadilha de auto- inoculação sem o patógeno como controle negativo. 3.3.1 Armadilha de auto-inoculação A descrição da armadilha de auto-inoculação desenvolvida está apresentada na Figura 1. Esta constitui-se de um tubo cilíndrico com diâmetro na parte superior de 7,50 cm e inferior de 6,5 cm sendo que na parte superior encontram-se distribuídos de forma triangular 10 orifícios para permitir a entrada dos insetos na armadilha. Internamente, separando a parte superior da parte inferior encontra-se um funil para evitar a fuga das brocas pela parte superior após entrarem na armadilha. Nas laterais da parte basal do compartimento inferior encontram-se conectados, de forma rosqueável, dois tubos cilíndricos de 8,0 cm de comprimento. Estes são transparentes, com orifício interno de 3,3 cm de diâmetro e uma abertura (3,3 × 3,5 cm) voltada para baixo da armadilha, para permitir a saída da broca da armadilha. Neste caso, a saída dos insetos seria estimulada pela entrada de luz pelo orifício dos tubos e devido ao fototropismo positivo apresentado pelas fêmeas “colonizadoras” da broca. Como a armadilha foi pintada de preto no compartimento inferior (11,5 cm), a entrada de luz ocorreu somente pelo orifício dos tubos contendo o tecido com fungo, por onde, então, as brocas foram forçadas a sair. A parte superior da armadilha foi pintada de vermelho (7,5 cm) e no local de união do funil foi colocada uma fita adesiva vermelha, já que reconhecidamente é atraente para fêmeas ‘colonizadoras’ de H. hampei (MATHIEU et al.,1997). Foi colocada uma cobertura circular preta de 19,5 cm de diâmetro onde com auxílio de um arame fino foi fixado um frasco difusor de vidro e com tampa de borracha com uma abertura central de 2 mm para permitir a liberação do atraente químico. Este frasco ficou na parte interna da armadilha, restrito ao local superior onde se encontra os orifícios para entrada das brocas. A cobertura também tem o objetivo de evitar a entrada de água da chuva. 36 A Vermelho Preto B 2,7 cm de Ø 2 cm de Ø 6 cm 1,5 cm de Ø 7 ,5 c m 1 6 ,5 c m 6,5 cm de Ø 7,5 cm de Ø 19 cm de Ø 8 c m C 1 2 Figura 1 – 1: A. Visão externa da armadilha de auto-inoculação. B. Visão interna mostrando de cima para baixo: tampa com rosca onde é fixado o frasco difusor, orifícios de entrada dos insetos, funil, compartimento inferior com duas aberturas onde são inseridos os tubos cilíndricos com rosca, C. Tubo cilíndrico, contendo na parte proximal, rosca para inserção no compartimento inferior da armadilha e onde a faixa de tecido com fungo é colada e na parte distal orifício para entrada de luz e para permitir a saída das fêmeas ‘colonizadoras’ de Hypothenemus hampei e 2: Foto da armadilha de auto-inoculação instalada no local do experimento Para montagem do tecido selecionado contendo o fungo na armadilha, inicialmente as faixas de Lã “Sherpa” (8 × 1 cm) foram autoclavadas a 120 oC por 20 min. Estas faixas foram então coladas com adesivo Cascola®, na parede interna dos tubos de saída (Figura 1 C) que haviam sido esterilizados com álcool 70% e submetidos à luz UV por 40 min. Os tubos contendo as faixas de tecido foram mantidos na câmara de fluxo por aproximadamente 12 horas para secagem da cola, sendo posteriormente expostos por 40 min sob luz UV. Em seguida, foi feita a impregnação do fungo no tecido por imersão do tubo de saída no meio de cultura contendo o fungo em crescimento, como descrito no item 3.2.1. Após a esporulação do patógeno, os tubos foram rosqueados nas armadilhas. Para garantir uma menor incidência de luz diretamente sobre o patógeno, foi colocada uma fita adesiva preta de aproximadamente 3 cm de largura externamente no tubo de saída transparente, na parte proximal onde localiza-se internamente a faixa de tecido. 37 3.3.2 Delineamento experimental dos estudos de camp o com armadilhas Os experimentos foram montados em área de café (C. arabica var. Catuaí Vermelho e Amarelo) sombreado de aproximadamente 0,8 ha, localizada na Fazenda Areão da ESALQ/USP. As plantas de café tinham aproximadamente seis anos de idade plantadas em espaçamento de 1,5 × 3,0 m. O sombreamento do local é provido por aproximadamente 500 árvores de eucaliptos de 12 anos de idade espaçadas aleatoriamente na área. Foram montados dois experimentos em épocas diferentes. Em ambos os experimentos, o delineamento adotado foi em blocos aleatorizados sendo utilizados 3 tratamentos: 1) armadilha de auto-inoculação (Figura 1) contendo o fungo, 2) armadilha de auto-inoculação sem o fungo e 3) armadilha modelo IAPAR (VILLACORTA et al., 2001) com abertura de 17,5 × 11,5 cm, usada como controle positivo. Esta última armadilha foi confeccionada com garrafas plásticas do tipo “Pet,” colocada de forma invertida sendo que na parte externa, próxima a abertura, foi colocado 10 cm de fita adesiva vermelha de 3 cm de largura, para aumentar a atração dos insetos. O modelo de armadilha de auto-inoculação sem o fungo foi usado para verificar se a presença (repelência) do fungo poderia reduzir a atratividade da armadilha e consequentemente a frequência de coleta dos insetos. Pela diferença de captura entre as armadilhas de auto-inoculação com e sem o fungo seria também possível determinar a infecção natural de H. hampei por B. bassiana. O modelo IAPAR foi usado para comparar a eficiência de coleta da broca- do-café desta com a armadilha de auto-inoculação, já que este modelo tem eficiência de captura comprovada. Para monitorar a viabilidade e a concentração do patógeno nas armadilhas, foi utilizado um modelo da armadilha de auto-inoculação modificado, contendo quatro saídas com fungo conforme especificado no item 3.3.2.2. Todos os tratamentos constituíram de quatro repetições (n=4). Cada armadilha constituiu de uma repetição, exceto para as armadilhas usada para avaliação da viabilidade e concentração onde cada armadilha continha 4 repetições (saídas com o patógeno). Todas as armadilhas foram fixadas em estacas, a 1,2 m do chão, espaçadas de 15 m em cada linha de café (bloco) e entre blocos. Como atraente químico foi usado o metanol: etanol (1:1) puro para análise, colocando cerca de 10 mL em frasco difusor de vidro com tampa de borracha com abertura de 2 mm (SILVA, 38 VENTURA, MORALE, 2006; UEMURA-LIMA et al., 2010). A cada avaliação o volume da mistura de atraentes volatilizados dos frascos difusores foram completados novamente para ficar sempre com a quantidade inicial. Para as armadilhas usadas para monitorar a concentração e a viabilidade do patógeno, não foram colocados frasco difusor com atraente químico. No início dos experimentos, a posição de todas as armadilhas foi aleatorizada, sendo a posição definida por sorteio. Na figura 2 está esquematizada a distribuição e distâncias das armadilhas usadas para captura da broca-do-café na área experimental. Para o primeiro experimento, as armadilhas foram distribuídas na região central da área experimental no dia 03-05-2012. Para o segundo experimento, montado em 07-09-2012, utilizou-se as extremidades da área para a alocação dos blocos sendo dois em cada extremidade. Foi deixada uma bordadura de aproximadamente 15 m das extremidades da área e de cada linha de café onde as armadilhas foram distribuídas. Para as armadilhas usadas no monitoramento da viabilidade e concentração do patógeno, estas foram dispostas em ziguezague na área, de forma que cada repetição ficou na linha de café imediatamente superior onde estavam as armadilhas usadas para captura dos insetos. 1oExperimento q 15 m 15 m 15 m 15 m 15 m 15 m 15 m 15 m 15 m 15 m 15 m 15 m 15 m 15 m 15 m 15 m 15 m 2º Experimento 2º Experimento Bloco I Bloco II Bloco III Bloco IVBloco I Bloco II Bloco III Bloco IV 15 m 15 m 15 m 15 m Armadilha de auto-inoculação Armadilha de auto-inoculação sem fungo Armadilha modelo IAPAR Legenda: Figura 2 – Esquema da distribuição das armadilhas: auto-inoculação, armadilha de auto-inoculação sem fungo e modelo IAPAR na área experimental 39 3.3.2.1 Captura de Hypothenemus hampei pelas armadilhas e avaliação da sua infecção por Beauveria bassiana na armadilha de auto-inoculação Para a quantificação do número de insetos capturados pelas armadilhas, amostragens semanais foram realizadas durante 24 semanas para o primeiro experimento e oito semanas para o segundo experimento (em andamento). A eficiência de captura da armadilha foi medida em relação ao número de brocas coletadas. Para que fosse possível quantificar o número de brocas capturadas pela armadilha de auto-inoculação com o fungo e na armadilha de auto-inoculação sem o fungo, no local de saída das brocas foi colocado saco plástico transparente, preso por liga de borracha (Figura 3). Para a armadilha IAPAR a captura dos insetos foi feita colocando na parte inferior da garrafa aproximadamente 200 mL de água mais 5% de detergente neutro. Para retirada das brocas da armadilha IAPAR, como a garrafa foi colocada de forma invertida, a tampa da parte inferior foi aberta e os insetos coletados em uma peneira e acondicionados em envelopes de papel. Nas outras armadilhas os sacos plásticos fixados a cada tubo de saída contendo os insetos coletados durante os intervalos de avaliações, foram retirados e levados ao laboratório para quantificação, sendo substituídos por novos sacos plásticos. Figura 3 – Saco plástico transparente colocado nos tubos de saída da armadilha de auto-inoculação para captura das fêmeas ‘colonizadoras’ de Hypothenemus hampei 40 A porcentagem de infecção nos insetos capturados pelas armadilhas de auto- inoculação com e sem o fungo, foi determinada em amostras de insetos capturados num período de 24 horas a cada semana. No modelo IAPAR a infecção não foi quantificada, pois os insetos eram coletados na água. Os insetos coletados foram levados ao laboratório e acondicionado em placas de Petri (9 cm), cobertas por tecido “voile”, alimentados com pergaminho de café hidratado e mantidos em B.O.D (25 ± 1 0C em escotofase, 60 ± 10% UR) por 10 dias. Os insetos mortos foram retirados diariamente das placas de Petri, esterilizados superficialmente com álcool 70% e então acondicionados em câmara úmida para confirmação da mortalidade pelo patógeno (Item 3.1.3). As avaliações para determinação da infecção foram realizadas no primeiro experimento com 1, 11, 17, 23, 29, 37, 45, 52, 57, 65, 81, 97, 102, 107, 141, 149, 151 dias após a montagem e no segundo experimento com 14, 20, 36, 40 dias após montagem. Ao final de cada semana de avaliação as armadilhas usadas na captura dos insetos foram aleatorizadas dentro do bloco para diminuir o efeito da localização. Durante a instalação do primeiro experimento até a 5ª semana de avaliação, a porcentagem de infestação de brocas na área foi quantificada, amostrando 10 plantas por bloco e retirando 10 frutos de cada. Posteriormente foi contabilizado o número de frutos brocados e sadios o que permitiu o calculo da porcentagem de infestação. Nos períodos posteriores este parâmetro não foi quantificado devido à colheita dos frutos. 3.3.2.2 Monitoramento da viabilidade e concentração de Beauveria bassiana produzido após impregnação sobre faixas de tecido na armadilha de auto- inoculação Neste estudo, a armadilha de auto-inoculação diferiu do modelo descrito no item 3.3.1 por possuir quatro saídas com o patógeno, dispostas em pontos equidistantes, ao invés de duas saídas (Figura 4). As armadilhas foram distribuídas na área experimental de forma aleatorizada na linha de café imediatamente superior as dos blocos dos experimentos descritos anteriormente (Figura 2) para monitoramento da concentração e viabilidade do patógeno. 41 Figura 4 – Armadilha de auto-inoculação com quatro tubos de saída contendo o fungo Beauveria bassiana impregnado em tecido têxtil, usados para avaliação da viabilidade dos conídios Para o primeiro experimento foram distribuídas quatro armadilhas e em cada tempo de avaliação (quatro avaliações) uma saída de cada armadilha (n= 4) foi retirada de forma aleatória e, levada para o laboratório em sacos plásticos estéreis. Em câmara de fluxo laminar, o tecido com o inóculo foi removido com uma pinça e colocado diretamente em frasco de vidro de 250 mL (marca Schott) contendo 50 ml de água + espalhante adesivo estéril. Em seguida a concentração e viabilidade do fungo foram determinadas conforme descrito no item 3.2.1. As avaliações foram feitas 0, 10, 20, 40, 65 dias após a instalação do experimento. A partir dos 120 dias, como não havia mais saídas com fungo nestas armadilhas, não foi possível estimar a concentração de conídios e a viabilidade foi monitorada através da retirada de pequenas amostras das armadilhas de auto-inoculação utilizadas para verificação da captura e infecção das brocas como descrito no item 3.3.2.2. Para retirar estas amostras, utilizou-se uma espátula de metal e uma pequena amostra do fungo foi retirado de cada um das duas saídas e colocadas microtubo tipo Eppendorf de 2 mL. No laboratório foi adicionado 1 mL de Tween 20® (0,05%), seguido de homogeneização em aparelho Vortex® e feitas duas diluições para posterior teste de viabilidade conforme item 3.1.3. No segundo experimento, a viabilidade foi monitorada de forma semelhante ao anterior, porém foram distribuídas de forma aleatorizada oito armadilhas, sendo duas por linha de café e espaçadas 15 m umas das outras. Para este experimento, em virtude da alta viabilidade encontrada para o primeiro experimento (ver seção 42 resultados) foram planejadas avaliações aos 0, 10, 20, 40, 65, 80, 100, 120 e 140 dias após a montagem e em cada avaliação uma saída com fungo foi coletada (n=4) de uma armadilha em cada linha (repetição). Como possuem duas armadilhas por linha, a saída foi retirada de forma aleatorizada, posteriormente procedeu às avaliações de concentração e viabilidade da mesma forma como no primeiro experimento. Este experimento foi instalado em 07/09/2012 e encontra-se em andamento sendo apresentados os resultados obtidos até 40 dias. 3.3.3 Dados climáticos A temperatura e umidade relativa do ar foram registradas por Data Logger ICEL Manaus® modelo HT- 4000 colocado na região central da área experimental próximo a planta de café a 1,2 m do nível do solo. Os dados referentes a precipitação foram obtidos da estação meteorológica da ESALQ/USP localizada à latitude: 22o 42' 30'' sul e longitude de 47o 38' 00'' oeste com altitude de 546 metros, em Piracicaba, São Paulo, Brasil. 3.4 Análise estatística As análises estatísticas foram realizadas utilizando-se o software R® versão 2.5.0 (R DEVELOPMENT CORE TEAM, 2007). Os dados referentes à seleção de isolados e exposição de fêmeas de H. hampei a conídios produzidos sobre tecido foram submetidos à análise de variância e as médias foram comparadas pelo teste de Tukey (P<0,05). A eficácia do controle foi determinada pela fórmula de Schneider-Orelli (1947). Para o cálculo do tempo letal médio TL50, os valores das mortalidades acumuladas foram submetidos à análise de Probit (FINNEY, 1971), com auxílio do programa Polo Plus. Para comparação dos tecidos sintéticos, a concentração de conídios viáveis.cm-2 de B. bassiana sofreu uma transformação logarítmica e os dados foram submetidos à análise de variância sendo as médias comparadas pelo teste de Tukey (P<0,05). O efeito da luz na produção e armazenamento de tecidos impregnados com B. bassiana ao longo do tempo foi ajustado por modelos logísticos para o parâmetro de viabilidade dado pela seguinte equação eq.(1): 43 eq.(1) Em que “a” é o parâmetro referente à assíntota, “b” é o tempo referente à metade do valor da assíntota e “c” é o parâmetro de escala. Quanto à concentração os dados foram submetidos a uma transformação logarítmica, para atender as pressuposições da normalidade e em seguida foi comparada por meio de modelos de regressão. A influência do armazenamento de tecido impregnado com B. bassiana em diferentes umidades relativas (UR) foi comparada por modelos mistos. Para o parâmetro concentração de conídios foram ajustados modelos mistos lineares. Para a viabilidade constataram-se, por meio de testes de razão de verossimilhanças e análise visual, que são necessárias três curvas para explicar o comportamento da viabilidade ao longo do tempo. Para 40% UR utilizou modelos lineares mistos e para as 60 e 80% de UR ajustaram-se modelos mistos não lineares, devido aos comportamentos se assemelharem ao comportamento de uma função exponencial negativa Para os dados de campo, a flutuação populacional da broca-do-café foi estimada pela média semanal das somas do número de brocas capturadas em todas as armadilhas mais erro padrão das médias (EP). Esses dados foram correlacionados com as médias semanais das variáveis climáticas, temperatura máxima (T MAX), mínima (T MIN) e média (T MED), umidade relativa máxima (UR MAX), mínima (UR MIN) e média (UR MED) e com a precipitação. Pelas pressuposições de normalidade, utilizou-se o coeficiente de correlação de Spearman (teste não paramétrico). Esta mesma correlação foi feita para os dados referentes à concentração e viabilidade do patógeno no campo levando em consideração a média dos dados climáticos referente a cada período de avaliação desse parâmetro. Estes parâmetros concentração e viabilidade ao longo do tempo também foram comparados por modelos de regressão. Para analisar a infectividade do fungo presente na armadilha de auto- inoculação, para o primeiro experimento, os dados de mortalidade total e confirmada foi ajustado a um modelo beta binomial inflacionado de zeros, considerando-se inicialmente os efeitos de armadilha (armadilha de auto-inoculação com fungo e sem fungo), de tempo e da interação entre armadilha e tempo. Para a verificação desses efeitos foram utilizados testes da razão de verossimilhanças. Assim, para os dados 44 referentes ao número de insetos mortos o modelo selecionado foi o modelo com efeito de armadilhas. Quanto ao número de insetos confirmados, o modelo selecionado foi o modelo com efeito de armadilhas e de tempo. Para o segundo experimento os dados de mortalidade total e confirmada foram expressos em média de mortalidade e erro padrão da média por não ter se ajustado ao modelo. Para os dois experimentos foi estimado também o TL50, usando os valores acumulados da mortalidade total, utilizando a mesma análise descrita anteriormente. 45 4 RESULTADOS E DISCUSSÃO 4.1 Resultados 4.1.1 Seleção de isolados de Beauveria bassiana para controle de Hypothenemus hampei A mortalidade total, confirmada e corrigida da broca-do-café pelos isolados de B. bassiana foram estatisticamente semelhantes (P> 0,05) (Tabela 3). Apenas para a mortalidade total houve diferença significativa entre os isolados e o tratamento controle (P< 0,05). Todos os isolados apresentaram baixa virulência sendo que a maior mortalidade total observada foi de 38,5% (ESALQ-1455). Não foi constatada mortalidade causada pelo patógeno (confirmada) no tratamento controle, sendo observada mortalidade total neste tratamento de 11,5%. Tabela 3 – Mortalidade total, mortalidade confirmada e mortalidade corrigida de fêmeas “colonizadoras” de Hypothenemus hampei a diferentes isolados de Beauveria bassiana aplicado na concentração de 107 conídios.mL-1, após dez dias a 25 ± 1 oC e escotofase de 24 horas Isolados Mortalidade Total (%)* Mortalidade Confirmada (%) ns 1Mortalidade Corrigida (%) ns Controle 11,5 ± 4,6 b ... - ESALQ-1455 38,5 ± 7,4 a 32,7 ± 5,6 30,5 ± 8,1 ESALQ-1457 34,6 ± 5,6 a 26,9 ± 5,8 26,1 ± 6,0 CB-66 32,7 ± 6,5 ab 28,8 ± 5,2 24,0 ± 7,0 ESALQ-1451 37,5 ± 7,3 a 32,7 ± 6,6 29,4 ± 8,0 ESALQ-1436 31,7 ± 9,0 ab 25,0 ± 8,1 22,8 ± 8,4 ESALQ-1081 36,5 ± 7,5 a 29,8 ± 7,6 28,3 ± 7,5 ESALQ-1456 33,7 ± 7,8 ab 26,0 ± 6,3 25,1 ± 7,9 ESALQ-252 34,6 ± 6,7 a 27,9 ± 5,8 26,1 ± 7,2 ESALQ-PL63 37,5 ± 4,6 a 34,6 ± 7,3 29,4 ± 8,3 * Médias ± Erro Padrão seguidas pela mesma letra na coluna não diferem estatisticamente pelo teste Tukey (P<0,05). ns Diferença não significativa (P>0,05). ... Dado numérico igual a zero não resultante de arredondamento, - Não se aplica dado numérico. 1Estimada pela fórmula de Schneider-Orelli (1947) 46 Como as porcentagens de mortalidade para todos os isolados foram baixas a virulência dos isolados não foi um parâmetro adequado para a escolha do melhor isolado. Escolhemos o isolado ESALQ-PL63 para prosseguir os estudos, testando novas abordagens para o controle dessa praga baseando-se no fato deste isolado já possuir registro junto ao Ministério da Agricultura e Abastecimento (MAPA). 4.1.2 Produção e viabilidade de Beauveria bassiana após impregnação em diferentes tecidos têxteis e seu potencial para con trole de Hypothenemus hampei 4.1.2.1 Seleção de um tecido têxtil para utilização como substrato de produção do fungo Beauveria bassiana após impregnação sobre os tecidos A concentração de conídios.cm-2 do fungo B. bassiana produzidos após impregnação sobre os diferentes tecidos apresentou interação tripla entre experimento, tecidos e a condição de luz. Desta forma procedeu-se a análise do efeito da interação dupla tecidos com condições de luz dentro de cada um dos dois experimentos. Para os dois experimentos o tecido sintético Lã “Sherpa” foi superior aos demais tecidos para as duas condições estudadas. Desta forma optou-se por apresentar os dados apenas de um dos experimentos (Tabela 4). Todos os tecidos têxteis avaliados como substrato para impregnação do meio contendo o isolado ESALQ-PL63 permitiram o crescimento e a conidiogênese do patógeno sobre a sua superfície, independente da condição de luz em que foram submetidos (Figura 5). O tecido sintético Lã “Sherpa” permitiu uma maior produção de conídios viáveis do patógeno, diferindo significativamente da maioria dos demais tecidos avaliados (P< 0,05) para as duas condições de luminosidade (Tabela 4). Somente para a condição de fotofase 12 h que sua produção foi semelhante ao tecido Poy Esmeralda. Os tecidos, Lã “Sherpa” e Poly R2 tiveram maior produção no escuro que quando mantidos em fotofase de 12 horas. Para as duas condições avaliadas a menor produção de conídios ocorreu quando impregnado sobre o tecido Sofit. Os demais tecidos tiveram uma produção intermediaria. 47 Tabela 4 – Concentração conídios viáveis.cm-2 de Beauveria bassiana ESALQ-PL63 produzidos após impregnação sobre diferentes tecidos têxteis e incubados por dez dias a 25 ± 1 oC, UR 60 ± 10% em duas condições de luz Tecidos Têxteis Concentração de conídios viáveis.cm -2* Fotofase 12 h (×10 8) Fotofase 0 h (×10 8) Lã “Sherpa” 3,78 ± 0,09 aB 5,44 ± 0,33 aA Poly Esmeralda 2,94 ± 0,20 abA 3,10 ± 0,13 bA Jade 200 2,28 ± 0,28 bA 2,70 ± 0,13 bA Poly R1 2,80 ± 0,06 bA 2,73 ± 0,19 bA Jade 100 2,77 ± 0,28bA 3,03 ± 0,15 bA Poly R2 2,30 ± 0,19 bB 3,14 ± 0,10 bA Sofit 1,33 ± 0,13 cA 1,77 ± 0,051cA *Médias ± E.P seguidas pela mesma letra maiúscula na linha e minúscula na coluna não diferem pelo teste de Tukey (P<0,05). Figura 5 – A. Crescimento do isolado ESALQ-PL63 de Beauveria bassiana após impregnação sobre o tecido têxtil sintético Lã “Sherpa” e B. Sobre o tecido sintético “Jade 200” e incubado por dez dias a 25 ± 1oC, UR 60 ± 10% e escotofase de 24 horas Diante destes resultados o tecido sintético Lã “Sherpa” foi escolhido para dar continuidade aos experimentos, para tentativa de utilização da técnica de impregnação de tecidos com o fungo B. bassiana para o controle de H. hampei. A B 48 4.1.2.2 Mortalidade de Hypothenemus hampei expostos por diferentes períodos a conídios de Beauveria bassiana produzidos após impregnação sobre tecido têxtil A mortalidade total, corrigida e confirmada de H. hampei após diferentes períodos de exposição aos conídios do isolado ESALQ-PL63 produzidos após impregnação sobre tecido têxtil não apresentaram diferenças estatísticas entre os tempos avaliados (P> 0,05), sendo que a mortalidade total, confirmada e a eficácia do controle foram superiores a 80% nos dois experimentos (Tabela 5). Para o segundo experimento a quantidade de conídios que ficaram aderidos sobre o corpo da broca-do-café em cada tempo de exposição, foram estatisticamente semelhantes (Tabela 5) variando de 2,83 × 105 a 2,89 × 105 conídios por broca. Pela sobreposição de intervalos de confiança, não houve diferença entre o tempo letal médio e os tempos de exposição, sendo que para ambos os experimentos o período para matar 50% da população da broca variou de 4,0 a 4,9 dias (Tabela 6). 49 Tabela 5 - Mortalidade total, mortalidade corrigida e mortalidade confirmada de fêmeas ‘colonizadoras’ de Hypothenemus hampei expostas por diferentes períodos a conídios do isolado ESALQ-PL63 de Beauveria bassiana produzidos após impregnação sobre o tecido têxtil Lã “Sherpa” e mantidas por dez dias em a 25 ± 1 oC, UR de 60 ± 10% Tratamento Mortalidade total (%) Mortalidade confirmada (%) ns 3Mortalidade corrigida (%) ns Conídios/broca (× 104)* 1º Experimento 1 Controle 17,3 ± 7,9 b ... - 5 s 88,5 ± 6,7 a 86,5 ± 5,8 86,1 ± 8,1 25 s 94,2 ± 5,8 a 94,2 ± 5,8 93,0 ± 7,0 50 s 94,2 ± 1,9 a 92,3 ± 3,1 93,0 ± 2,3 Controle 5,8 ± 5,8 b ... - ... 2º Experimento 2 5 s 88,5 ± 7,4 a 88,5 ± 7,4 87,8 ± 7,8 28,9 ± 3,9 ns 25 s 92,3 ± 5,4 a 90,9 ± 4,8 91,8 ± 5,8 28,3 ± 3,7 50 s 90,4 ± 7,9 a 88,5 ± 2,2 89,8 ± 2,0 28,9± 1,6 Médias ± Erro Padrão seguidas pela mesma letra na coluna não diferem pelo teste de Tukey (P<0,05). ns diferença não significativa (P>0,005).* avaliação feita apenas no 2º. Experimento; ... Dado numérico igual a zero não resultante de arredondamento, - Não se aplica. 1Concentração do fungo sobre o tecido de: 7,66 ± 0,26 × 108 (Média ± E.P) conídios viáveis.cm-2. 2Concentração do fungo sobre o tecido de: 4,27 ± 0,26 x 108 (Média ± E.P) conídios viáveis.cm-2. 3Estimada pela fórmula de Schneider-Orelli (1947) 49 50 Tabela 6 – Estimativa do tempo letal médio (TL50), em dias, e intervalo de confiança para fêmeas de Hypothenemus hampei após serem expostas por diferentes períodos a conídios de Beauveria bassiana ESALQ-PL63 produzidos após impregnação sobre o tecido têxtil Lã “Sherpa” e mantidas por dez dias a 25 ± 1 oC, UR 60 ± 10% Tratamento n TL 50 (IC) Coeficiente angular (± E.P) X2 g.l. 1º Exp. Controle 52 - - - - 5 s 52 4,5 (3,8; 5,1) 3,5 ± 0,3 15,2 8 25 s 52 4,0 (3,6; 4,3) 4,1 ± 0,3 7,2 8 50 s 52 4,0 (3,5; 4,6) 4,2 ± 0,3 17,2 8 2º Exp. Controle 52 - - - 8 5 s 52 4,6 (4,2; 5,0) 4,8 ± 0,4 10,3 8 25 s 52 4,8 (4,5; 5,2) 4,8 ± 0,4 5,4 8 50 s 52 4,9 (4,6; 5,3) 4,2 ± 0,3 5,0 8 Exp: experimento; n.: número de insetos testados; IC: Intervalo de confiança a 95% de probabilidade de erro; X2: valor de qui-quadrado calculado; g.l.: graus de liberdade; – não si aplica. 4.1.2.3 Influência da luz na viabilidade e concentra ção de conídios de Beauveria bassiana produzidos após impregnação em tecido têxtil Para o parâmetro concentração de conídios ao longo do tempo de armazenamento, foi observada pela análise de variância uma interação tripla significativa entre os três experimentos, para os parâmetros dias de armazenamento e as condições de luz em que o tecido contendo o patógeno foi armazenado, desta forma, procedeu ao estudo de desdobramento. Para os três experimentos houve a tendência de maior concentração de conídios quando o patógeno foi produzido em fotofase de 12 horas do que quando foram mantidos no escuro. O comportamento da concentração ao longo do tempo diferiu entre os experimentos sedo que foram ajustados modelos de regressão linear, quadrático e cúbico. Entretanto, em todos os experimentos, e para as duas condições de armazenamento, observou-se uma tendência de redução da concentração em função do tempo de armazenamento. Desta forma, optamos por apresentar, para este parâmetro, os dados referentes apenas um dos experimentos (Figura 6 A). Foi observada interação significativa para a produção e viabilidade de conídios de B. bassiana em função do tempo de armazenamento e a condição de luz que foram mantidos (P<0,05). Independente da condição de luz, a concentração 51 e viabilidade reduziram ao longo do tempo de armazenamento (Figura 6). Quanto à concentração, o armazenamento em 12 h de fotofase ajustou-se o modelo exponencial: exp(2,04 × 101 – 5,61 × 10-2 *dias + 2,37 × 10-3 *(dias)2 - 3,11 × 10-5 *(dias) 3), e para 0 h de fotofase ajustou-se ao modelo: exp(2,00 × 101 – 5,61 × 10-2 *dias + 2,37 × 10-3 *(dias)2 -3,11 × 10-5 *(dias) 3). A concentração inicial do patógeno foi maior para a condição de fotofase de 12 h, com 4,9 x 108 conídios.cm-2 do que quando o fungo foi produzido no escuro com 3,7 × 108 conídios.cm-2. O comportamento da viabilidade foi ajustado por modelos logísticos. O armazenamento em 0 hora de fotofase é dado pela equação eq.(2): eq.(2) Para o armazenamento em 12 horas de fotofase o comportamento da viabilidade se ajustou pela equação eq.(3): eq.(3) A viabilidade foi drasticamente reduzida, quando os conídios foram mantidos no escuro, chegando próximo de zero aos 30 dias após inoculação. Para os tecidos com o fungo mantidos com 12 horas de fotofase a viabilidade manteve-se por mais tempo sendo que com 45 dias de inoculação apresentava aproximadamente 35% de viabilidade (Figura 6 B). 52 10 15 20 25 30 35 40 45 0 1 2 3 4 5 6 C on íd io s. cm -2 (x 10 8 ) 12 h fotofase 0 h fotofase 10 15 20 25 30 35 40 45 0 20 40 60 80 100 12 h fotofase 0 h fotofase V ia bi lid ad e (% ) Dias após armazenamento A B Figura 6 – A. Concentração e B. Viabilidade de conídios Beauveria bassiana ESALQ-PL63 produzidos após impregnação sobre o tecido têxtil Lã “Sherpa” após diferentes tempos de armazenamento a 25 ± 1 oC, UR 60 ± 10% fotofase de 0 e 12 horas. 4.1.2.4 Viabilidade e concentração de conídios de Beauveria bassiana produzidos após impregnação sobre tecido têxtil ao longo do armazenamento em diferentes umidades relativas do ar Não foram observadas diferenças estatísticas significativas entre as concentrações de conídios quando os tecidos foram armazenados a 60 e 80% de UR (P> 0,05), sendo os resultados expressados por um único modelo de regressão linear da concentração em função do tempo (x = 4,59E × 108 - 8,89 × 105 * dias). O tecido impregnado com B. bassiana armazenado a 40% de UR apresentou um ligeiro aumento linear na concentração ao longo do tempo de armazenamento, diferindo das demais UR (P< 0,05), explicado pelo modelo: x = 4,59 × 108 + 1,78 × 105 *dias (Figura 7 A). 53 Por meio de testes de razão de verossimilhanças foram necessárias três curvas para explicar o comportamento da viabilidade ao longo do tempo em função do armazenamento nas diferentes UR, sendo que as três umidades diferem entre si (P< 0,05). O armazenamento em 40% de UR foi explicado pelo modelo linear misto: X= 107,3 – 2,2*dias. A viabilidade nas condições de 60 e 80% de UR ajustaram-se a modelos mistos não lineares, devido se assemelharem ao comportamento de uma função exponencial negativa, sendo X= 183,0*exp(-0,12*dias) e X= 254,0*exp(- 0,19*dias), respectivamente. De forma geral, com o aumento da UR reduziu a concentração e a viabilidade do patógeno presente no tecido. Quando o tecido impregnado com B. bassiana foi armazenado a 40% de UR a viabilidade reduziu linearmente ao longo do tempo. Porém, observou-se uma redução exponencial acentuada para as condições de 80 e 60% de UR, respectivamente (Figura 7 B). 5 15 25 35 45 0 20 40 60 80 100 V ia bi lid ad e (% ) Dias após armazenamento UR 40% UR 60% UR 80% 5 15 25 35 45 4,0 4,2 4,4 4,6 4,8 5,0 C on íd io s. cm -2 (x 10 8 ) UR 40% UR 60 e 80% A B Figura 7 – A. Concentração e B. Viabilidade de conídios Beauveria bassiana ESALQ-PL63 produzidos após impregnação sobre o tecido têxtil Lã “Sherpa” após diferentes tempos de armazenamento a 25 ± 1 oC em diferentes umidades relativas do ar (UR) e fotofase de 12 horas 54 4.1.3 Eficiência de armadilha de auto-inoculação pa ra o controle de Hypothenemus hampei com Beauveria bassiana em tecido sintético em condições de campo No primeiro experimento instalado em 03-05-2012, coletou-se em 24 semanas de avaliações um total de 8.942 adultos H. hampei considerando todas as armadilhas presentes na área (N=12). No início da instalação desse experimento a infestação de broca-do-café na área foi estimada em 59,5 ± 5,8%, considerando o número de frutos de café brocados, sendo uma média de 47,0 ± 3,7% de infestação até a 5ª semana de avaliação (03/05 a 07/06), quando foi possível esta quantificação. As maiores quantidades de insetos foram capturadas nas avaliações de 10/05 a 02/08, sendo que o maior pico de coleta ocorreu em 14/06, capturando um total de 1499 insetos (93,6 insetos/armadilha) (n=4) (Figura 8 A). A análise de correlação de Spearman (Tabela 7) mostrou que a quantidade de brocas-do-café coletadas ao longo das avaliações foi influenciada diretamente pelas condições ambientais presentes na área. Observou-se uma correlação negativa significativa entre o número de brocas e a temperatura máxima e média, sendo que o aumento da temperatura levou a redução do número de brocas coletadas. Existe uma correlação positiva entre número de brocas e umidade relativa (máxima, mínima e média) e a precipitação, onde à medida que aumentam essas variáveis ocorre um aumento também na coleta de brocas. Durante todo período de avaliação a maior temperatura registrada foi de 36,8 oC, a mínima de 5,5 oC e média de 19,35 oC. A menor UR foi de 21,3% e máxima de 100%. Em geral as menores temperaturas médias, maiores UR e maiores quantidades de chuva ocorreram nas avaliações de 10/05 a 02/08, ocasião em que se deram as maiores coletas de brocas (Figura 8). Poucos insetos foram coletados entre 02/08 e 18/10, exceto na avaliação de 27/09 quando foram coletados vários insetos, devido ao fato de que nesta semana choveu mais de 6 mm, enquanto que entre 26/07 e 20/09 nenhuma precipitação havia sido observada. 55 A B M éd ia de b ro ca s/ se m an a co ns id er an do to da s as a rm ad ilh as P re ci pi ta çã o (m m ) U m id ad e R el at iv a (% ) T em pe ra tu ra ( o C ) Data da avaliação semanal 0 2 4 6 8 10 12 0 50 100 150 200 250 300 350 400 450 500 0 20 40 60 80 100 UR MAX UR MIN UR MED 0 5 10 15 20 25 30 35 40 1 0 /m a i 1 7 /m a i 2 4 /m a i 3 1 /m a i 0 7 /ju n 1 4 /ju n 2 1 /ju n 2 8 /ju n 0 5 /ju l 1 2 /ju l 1 9 /ju l 2 6 /ju l 0 2 /a g o 0 9 /a g o 1 6 /a g o 2 3 /a g o 3 0 /a g o 0 6 /se t 1 3 /se t 2 0 /se t 2 7 /se t 0 4 /o u t 11 /o u t 1 8 /o u t T MAX T MIN T MED Figura 8 – A. Flutuação populacional de Hypothenemus hampei durante o período experimental (03- 05-2012 a 18-10-2012) e precipitação média, B. Umidade relativa máxima (UR MAX), mínima (UR MIN) e média (UR MED), C. Temperatura máxima (T MAX), mínima (T MIN) e média (T MED), Piracicaba, São Paulo, Brasil C 56 Tabela 7 - Coeficiente de correlação (C.C) de Spearman entre as variáveis: temperatura máxima (T MAX), mínima (T MIN) e média (T MED), umidade relativa máxima (UR MAX), mínima (UR MIN) e média (UR MED) e a precipitação média em relação à captura de broca- do-café T MX T MIN T MED UR MAX UR MIN UR MED Precipitação C.C -0.46 -0.01 -0.47 0.62 0.61 0.57 0.37 Valor-p < 0,0001 0.888 < 0,0001 < 0,0001 <0,0001 < 0,0001 < 0,0001 No experimento instalado em 07-09-2012, no qual ainda não havia disponibilidade de frutos de café nas plantas, coletou-se em 8 semanas de avaliações um total de 2.325 adultos de H. hampei considerando todas as armadilhas presentes na área (N=12) (Figura 9 A). O maior número de brocas capturadas neste período foram nas avaliações do dia 21/09 e 19/10. De forma similar ao primeiro experimento, os picos de captura coincidiram com os dias de maiores precipitações (Figura 9 A). No entanto, esta observação foi feita apenas com base em observação visual, pois, nenhum parâmetro climático apresentou uma correlação significativa pelo teste de correlação de Spearman (P>0,05) para este experimento. A temperatura máxima registrada nesse período foi de 36,8 oC e mínima de 9,5 oC. A temperatura média foi de 23,0 oC sendo superior a média do primeiro experimento. A UR variou de 24,6 a 97,1% (Figura 9 B e C). 57 A 0 20 40 60 80 100 UR MAX UR MIN UR MED 0 10 20 30 40 14/set 21/set 28/set 05/out 12/out 19/out 26/out 02/nov T MAX T MIN T MED M éd ia d e br oc as /s em an a co ns id er an do to da s as a rm ad ilh as P re ci pi ta çã o (m m ) U m id ad e R el at iv a (% ) T em pe ra tu ra ( o C ) Data da avaliação semanal * * 0 2 4 6 8 10 0 50 100 150 200 250 300 Figura 9 – A. Flutuação populacional de Hypothenemus hampei durante o período experimental (07- 09-2012 a 02-11-2012) e precipitação média, B. Umidade relativa máxima (UR MAX), mínima (UR MIN) e média (UR MED), C. Temperatura máxima (T MAX), mínima (T MIN) e média (T MED), Piracicaba, São Paulo, Brasil. *Dados climáticos referentes à 02/11 não foram coletados devido a defeito no aparelho B C 58 A armadilha modelo IAPAR capturou nos dois experimentos um número muito superior de brocas do que as armadilhas de auto-inoculação e a armadilha de auto-inoculação sem fungo diferindo significativamente entre elas (P<0,05) (Tabela 8). Durante o primeiro experimento, a armadilha IAPAR capturou em média 1613,25 ± 348,25 brocas/armadilha, contra 323 ± 26,57 e 248,75 ± 74,70 brocas/armadilha para as armadilhas de auto-inoculação e a armadilha de auto-inoculação sem fungo, respectivamente. Durante o segundo experimento, a mesma tendência de captura se manteve sendo maior para IAPAR seguida da armadilha de auto-inoculação e armadilha de auto-inoculação sem fungo. Entretanto, a captura dos dois últimos tipos de armadilhas não diferiu estatisticamente nos dois experimentos (P>0,05) (Tabela 8). Tabela 8 - Número médio acumulado de Hypothenemus hampei coletada por armadilha ao final de 24 semanas para o 1º experimentos (03-05-2012 a 18-10-2012) e 8 semanas para o 2º experimento (07-09-2012 a 02-11-2012), Piracicaba, São Paulo, Brasil Armadilhas T